索氏法提取艾叶精油的化学组成及其抑菌活性

张萍，魏佳佳，杨永建，刘池，苏汉林，张珍明

（1.连云港职业技术学院科技产业处，江苏 连云港 222006；2.江苏海洋大学环境与化学工程学院，江苏 连云港 222005；3.南通市爱灸堂保健用品有限公司，江苏 南通 226000）

艾草是一种菊科多年生草本植物，其植株有清冽芳香气味，具有抗菌、抗炎症、抗衰老等功效。艾草在传统中医药防疫中的应用历史十分悠久，艾叶熏蒸的防疫应用十分广泛[1]。艾草提取物已经被现代医学的药理研究证明，其抗菌谱较宽，能够有效抑制甚至杀死很多细菌和病毒，能在一定程度上抵御呼吸系统疾病的发生[2]。国内外学者对艾草各部位的化学成分进行了较为广泛的研究，发现艾草中主要活性成分可依据沸点不同分为挥发性化合物：精油、萜类，非挥发性化合物：黄酮、酚酸和多糖类[3]。不同种属、产地、提取方式的艾草的化学成分之间存在较大差别。艾草提取物还对糖尿病和癌症疾病有治疗和预防的作用，可抑制细胞炎症和凋亡的发生，抗血小板的生成，同时促进血管的舒张[4]。艾草作为绿色、纯天然、可食用的野生中草药，在中国分布广泛，开发其营养、药用和商用价值的前景十分广阔。艾叶是艾草的干叶，主要的生物活性成分是有机酸、挥发油和黄酮类化合物，艾叶中有机酸的生物活性主要是抗病毒、清除自由基等。艾叶油的生物活性是抗菌、抗氧化等。目前艾叶精油的常用提取方法一般包括水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、超临CO2萃取法、微波辅助萃取法等[5-6]。

笔者以石油醚为溶剂，采用索氏萃取法提取出艾叶精油，并与传统的水蒸气蒸馏法做对比。通过气质联用色谱，结合指纹图谱，确定精油的成分及含量，并通过抑菌实验探讨艾叶精油的抑菌活性。

1 仪器和材料

1.1 主要仪器

索氏提取仪YSXT-06（上海熙杨有限公司），水蒸气蒸馏仪HB-101A（慈溪市宏邦电器有限公司），电子天平YP 1201N（上海精密仪器有限公司），循环水式真空泵RE-52A（南京金正仪器教学有限公司），旋转蒸发器RE-32（上海亚荣生化仪器），破壁搅拌机800Y（永康市铂欧五金制品有限公司），气相色谱质谱联用仪BD9-GC-4003A（北京中西远大科技有限公司），色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm,0.25 μm）。

1.2 药品和试剂

艾草样品采于江苏南通，石油醚（30～60℃），供试菌株为金黄葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌病原菌，由江苏海洋大学海洋科学与水产学院微生物实验室提供；供室培养基为牛肉膏蛋白胨培养基（用于金黄葡萄球菌和大肠杆菌）、PDA培养基（用于白色念球菌）。

2 实验方法

2.1 艾叶精油提取

2.1.1 索氏萃取法

将艾叶洗净，沥干，切碎，取出50 g，用200 mL石油醚浸泡2 h，转移至索氏提取仪中提取，艾叶碎用滤膜包住放入萃取管中，加热回流至萃取管中溶液颜色较浅，待恰好完成一次虹吸时停止萃取，减压蒸馏，得浅黄色有特殊清香气味的液体2.135g，收率4.27%。

2.1.2 水蒸气蒸馏法

将100g切碎的艾叶，加入200mL蒸馏水，浸泡2h，参照《中华人民共和国药典（2020年版）》四部中挥发油测定法甲法测定艾叶挥发油[7]203-204。浸泡完毕后倒入圆底烧瓶中，煮沸后保持微沸状态，待馏出液没有油产生时关闭水蒸气发生装置，得蓝绿色液体0.14g，收率0.14%。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 供试品溶液制备

分别取两种不同方法制取的艾草精油20mg，精密称定，分别置于2mL容量瓶中，加正己烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.2 GC-MS检测

气相色谱条件：进样口温度240℃；载气（He）流量：1mL/min；分流比：20：1；进样量：1μL；溶液延迟：6.5 min。程序升温过程如下：初始温度50℃，以3℃/min速率升温至75℃，保持温度15 min，以10℃/min的速率升温至175℃，保持3 min，以20℃/min的速率升温至240℃，保持3 min，260℃后运行3 min。

质谱条件：电离方式EI离子源；电离电压70eV；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；接口温度250℃；质量范围60~300 m/z。

2.3 艾叶精油的抗菌性测定

2.3.1 含药平板制备

按配方制备培养基，过滤分装至锥形瓶中，加塞包扎，0.1 MPa压力灭菌20min，搁置斜面，做无菌检测后将其倒入内径一致、事先放置平面的培养皿中，凝固后干燥，以平板中没有可见水滴为基准。

2.3.2 指示菌菌悬液涂布

按稀释涂布平板法，将各菌种用移液枪准确量取1mL，放入盛有9mL的试管中，振摇约20min，使细菌分散，用一支1mL无菌吸管吸取1mL稀释菌液，加入盛有9mL无菌水的试管中并充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4稀释度的菌液。用无菌管分别从10-2、10-3、10-4稀释度的菌液中吸取0.2 mL对号放入已写好稀释度的平板中央位置，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，每个培养皿按标记好的位置均匀放置牛津杯。吸取一定浓度的艾草精油0.2 mL至标记好的牛津杯中。将金黄葡萄球菌及大肠杆菌对应的牛肉膏蛋白胨培养基放置无菌温室中28℃培养2d，白色念球菌对应的PDA培养基放置无菌温室中28℃培养3d。

3 实验结果与分析

3.1 两种提取方法比较

索氏萃取法收率4.27%，显著高于水蒸气蒸馏法0.14%的收率。水蒸气蒸馏装置由水蒸气发生装置、蒸馏装置、冷凝装置和接收装置4个部分组成，在提取挥发油时，收集油相后再进行二次回流提取，仍能收集到少量挥发油，并不能一次有效地将水溶性较强的挥发油充分提取，故水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油得率较低[8]。但水蒸气蒸馏法工艺简单、操作简便、环保、生产成本低。有机溶剂萃取法所需设备简单、投资小，精油提取率高，但是此法提取的植物精油纯度较低，产品中残留溶剂难以除去[9]。

3.2 精油成分解析

根据GC-MS谱图，对照NIST 14指纹标准图谱库，CAS号查询确认化合物归属，总离子流图峰面积归一法测定各化合物的相对质量分数，结果见表1。索氏法提取艾叶精油中约含35种不同的物质，水蒸气蒸馏法提取艾叶精油中含47种不同的物质。

表1 GC-MS检测分析艾叶精油成分及含量

续表1

续表1

其中桉油精、β-石竹烯、氧化石竹烯、α-松油醇、β-侧柏酮、顺-4-侧柏醇、1,7,7-三甲基-二环[2.2.1]庚-2-醇、α-雪松烯、叶绿醇、（-）-蓝桉醇和泪柏醚等11种成分是两种提取方法共有的，分别占索氏法和水蒸气法提取精油总量的54.35%和26.77%。艾叶精油的主要有效成分，桉油精又称1,8-桉叶油素，被广泛应用于医药、配制牙膏香精或调味品中，具有抗菌、抗炎、杀虫、镇痛、促进透皮吸收等作用，是《中国药典》中艾叶含量测定的指标成分。β-石竹烯具有局部麻醉作用和治疗结肠炎作用[10]。α-松油醇有刺激胰岛素的能力，能降低血糖，能促进肌酸的吸收,常作为肌酸产品添加剂。索氏法和水蒸气法提取精油中的桉油精、β-石竹烯和α-松油醇分别占挥发油总量的13.86%、5.97%、6.20%和5.57%、3.93%、1.39%。索氏法提取的艾叶挥发油中3种有效成分的含量均高于水蒸气蒸馏法。

3.3 精油的抑菌效果

依次量取艾草精油，考察对3种菌种的抑制效果，透明圈直径见表2。

表2 艾叶精油对不同菌种的抑菌直径

根据抑菌圈直径，索氏法提取精油对金黄葡萄球菌的抑菌直径为11.2 mm，处于10mm＜d＜14 mm，对金黄葡萄球菌有中敏感度，对大肠杆菌抑菌直径为19.3mm，d＞14 mm，对大肠杆菌有高敏感度，对白色念球菌的抑菌直径d＜10 mm，对白色念球菌有低敏感度；水蒸气蒸馏法提取精油对金黄葡萄球菌的抑菌直径d＜10 mm，对金黄葡萄球菌有低敏感度，对大肠杆菌抑菌直径d＜10 mm，对大肠杆菌有低敏感度，对白色念球菌没有抑菌作用。索氏萃取法对三个菌种的抑菌作用高于水蒸气蒸馏法。