肿瘤相关巨噬细胞、胶质瘤干细胞和PF-L1在不同病理分级脑胶质瘤组织中的表达及相关性研究

王晓英 万学锋 任艳霞

脑胶质瘤本身具有强破坏性、高侵袭性、进展迅速等特点[1,2]，主要分为高级别型和低级别型，其中高级别致死率高，中位生存期方面胶质母细胞瘤病人存活时间不足1年。近年研究发现，脑胶质瘤致死率高的主要原因是由于其能够诱导产生局部和系统性的免疫抑制，而免疫抑制状态下，肿瘤生长迅速，且不受免疫系统攻击。而在免疫抑制过程中，肿瘤组织的微环境以及脑胶质瘤干细胞发挥关键作用[3,4]。PD-L1作为一种负性共刺激分子可以让肿瘤细胞出现免疫逃逸，目前临床开始重点研究该蛋白[5-7]。CD133作为胶质瘤干细胞(GSCs)的重要标志物，临床和科研中CD68广泛被用作肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)标志物。故本研究分析病理分级不同的脑胶质瘤组织中CD133、PD-L1和CD68的表达及相关性，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年4月至2020年6月神经外科收治的脑胶质瘤患者68例为研究对象，男性40例，女性28例，年龄24～68岁(中位年龄46岁)。纳入标准：第一次确诊为脑胶质瘤者；经手术切除治疗，术后取得标本；术前未接受放、化疗；对本研究知情同意。排除标准：合并其他恶性肿瘤、糖尿病和风湿免疫性疾病等；临床、随访资料不完整者。按照WHO在2007年制定的标准将其分为Ⅰ级和Ⅱ级(低级别胶质瘤)和Ⅲ级和Ⅳ级(高级别胶质瘤)，本研究低级别组34例，其中Ⅰ级9例，Ⅱ级25例；高级别组34例，其中Ⅲ级14例，Ⅳ级20例。两组患者一般资料可比(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 小鼠抗人CD68抗体(批号：ab201973)、兔抗人PD-L1抗体(批号：ab213524)均购自Abeam公司；兔抗人CDl33抗体(产品编号：bs-0395R)购自北京博奥森公司；SP试剂盒(批号：KIT-9720)、DAB显色试剂盒(批号：DAB-0031)、缓冲液等均购于上海西格生物科技有限公司。

1.2.2 检测方法 切取每例患者3张不间断的石蜡标本，厚度在4 μm左右，按照说明书对其中的CDl33、PD-L1和CD68蛋白进行免疫组化染色。在400倍的视野下寻找不间断的3张切片的相同区域位置，然后拍照，染色结果用Image-Pro 软件分析其光密度，从而定量分析不同病理级别的脑胶质瘤组织内的CD133、PD-L1和CD68蛋白的表达情况。每张切片随机观察视野区域个数超过20个。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达

CD133、PD-L1和CD68在高级别组脑胶质瘤组织内的表达量显著高于低级别组，差异显著(P<0.001)。见表1。

表1 CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达

2.2 CD133、PD-L1和CD68表达与脑胶质瘤病理分级的相关性

CD133、PD-L1和CD68在脑胶质瘤组织中的表达与其病理分级呈正相关，见表2。

表2 CD133、PD-L1和CD68表达与脑胶质瘤病理分级的相关性

3 讨论

脑胶质瘤高恶性程度，且患者预后极差，确诊后采取各种措施综合治疗后，复发率仍较高[8]。随着肿瘤病理学研究的不断深入，Paget提出的肿瘤生长的“土壤和种子”学说[9]，这使恶性肿瘤的认识有了飞跃式的进步。在脑胶质瘤组织内，GSCs作为“种子”可以利用诱导产生免疫抑制，进而使肿瘤细胞可以不让自身的免疫系统监视、清除，在放化疗过程中具有很强的抵抗性。GSCs被当做脑胶质瘤的起源细胞，有报道[10-12]表明，GSCs本身具有的逃避人体免疫监控能力和肿瘤微环境这种作为“土壤”的PD-L及巨噬细胞等关键成分之间关系密切。免疫细胞、肿瘤细胞以及各类因子共同构成的肿瘤微环境，其细胞成分中具有大量的TAMs[13]，脑胶质瘤组织内大量的巨噬细胞/小胶质细胞浸润在TAMs中，占肿瘤细胞团比例接近4成，远超淋巴细胞数量，说明了TAMs在脑胶质瘤细胞免疫逃逸中发挥着极为重要额作用[14,15]。B7家族的负性共刺激分子成员之一的PD-L1，可以作用于受体PD-1，从而让肿瘤免疫逃逸产生作用。因此，研究肿瘤组织中PD-L1蛋白的表达及调控对于脑胶质瘤意义重大。

在脑胶质瘤的组织细胞当中，同时存在GSCs、PD-L1和TAMs，但过去大量研究集中在PD-L1在TAMs和GSCs分开表达，对于它们是否在免疫逃逸中发挥作用的研究，并不多见。本研究探究了病理级别存在差异脑胶质瘤的组织内CDl33、PD-L1和CD68的表达及相关性，结果发现，脑胶质瘤的组织内PD-L1和CD68在巨噬细胞上共同表达，即PD-L1为阳性的巨噬细胞大多和肿瘤相关，且随病理级别上升，PD-L1和CD68蛋白水平亦上升。脑胶质瘤组织内的CDl33、PD-L1和CD68 mRNA在的表达和病理分级呈正相关；高级别组中三者的表达水平较低级别组高；进一步分析发现，脑胶质瘤的组织细胞内的CDl33、PD-L1、CD68表达在不同病理分级中呈正相关。提示脑胶质瘤的恶性程度和CDl33、PD-L1和CD68的表达关系密切，且以往研究发现，CDl33、CD68均与PD-L1均存在一定的正相关关系。表明三者在脑胶质瘤发展中共同发挥作用。这可能是GSCs通过诱导TAMs高表达PD-L1，从而让机体的免疫监视无法探测到，加速脑胶质瘤细胞快速生长。因此通过“种子”与“土壤”进行双向调节，从而避免胶质瘤进一步恶化，或可为临床治疗带来新的思路。

综上所述，PD-L1在胶质瘤组织内主要通过肿瘤微环境中的TAMs进行表达；脑胶质瘤的恶性程度和CDl33、PD-L1和CD68表达关系密切。