小龙虾虾壳对液态酿造米醋的影响

周宇科，付诗鸣，任汐月，郑吴伟，祁勇刚，胡 勇

（湖北工业大学 生物工程与食品学院 湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068）

虾壳是小龙虾加工过程中的副产物，约占小龙虾质量的33%，不但造成生物资源浪费严重，而且会对环境造成污染[1-2]。虾青素广泛存在于虾、蟹等水产品中，具有抗衰老、抗肿瘤、预防心脑血管疾病和抗糖尿病等多种生理功能[3-4]。虾青素常见的提取方法包括碱提法、酶解法和有机溶剂浸提法等，但通常都有提取效果较低、有机溶剂残留和成本昂贵等问题[5-6]。张莉莉等[7]使用膦基盐离子液体替代咪唑基离子液体，以卵磷脂替代亲水性表面活性剂构筑一种新型微乳液体系，采用超声辅助从南极磷虾壳中提取虾青素，虾青素提取率可达97.75%，提取量为（48.21±0.07）μg/g。罗建光[8]采用超临界CO2法从小龙虾中提取虾青素，最佳的提取温度为40 ℃，最佳的夹带剂为1倍剂量的体积分数95%的乙醇，CO2流量为30 L/h，最佳的提取压力为30 MPa，提取温度为50 ℃，分离温度为40 ℃，物料粒径为0.425 mm，虾青素产率最高，可达26.13 μg/g。SACHINDRA N M等[9-10]使用有机混合溶剂（异丙醇∶己烷=1∶1，V/V）从虾壳废料中提取虾青素的产率最高。然而，丙酮等有机溶剂具有易挥发、致毒的缺点，在食品加工过程中可能存在试剂残留，危害生产人员健康等安全隐患。

食醋中含有丰富的营养成分，除乙酸外，还含有其他有机酸类、醇类、酯类、酮类和醛类物质[11-12]，可以作为有机溶剂溶解虾壳中的虾青素[5]。液态发酵食醋具有自动化程度高、原料利用率高、生产周期短、产品质量稳定的优势，将虾壳作为原料之一用于液态食醋酿造，既避免资源浪费，又能制备出富含虾青素的功能性食醋[13-14]。

本研究在米醋酿制的不同阶段添加虾壳，考察在不同发酵阶段添加虾壳对米醋（本文简称虾壳米醋）风味和抗氧化活性的影响，以期为工业化生产虾青素及虾青素产品的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

新鲜小龙虾虾壳（本文简称虾壳）：由德炎水产食品股份有限公司提供；高活性干酵母：安琪酵母有限公司。

大米：市售；巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41：中国工业微生物菌种保藏管理中心；黑曲霉（Aspergillus niger）：湖北工业大学食品发酵工程技术研究室保藏。

1.1.2 培养基

醋酸菌液体培养基[1]：20 g/L葡萄糖，20 g/L酵母提取物，10 g/L蛋白胨。

黑曲霉液体培养基[1]：5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，1 g/L KH2PO4，0.5 g/L Mg2SO4，0.033 g/L孟加拉红，0.1 g/L氯霉素。

以上培养基均于115 ℃灭菌30 min。

1.1.3 试剂

酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、Mg2SO4、氢氧化钠、福林酚、没食子酸、盐酸等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；孟加拉红：福州飞净生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海梯希爱化成工业发展有限公司；耐高温α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10万U/g）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5975C气相色谱-质谱联用（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）仪、Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）、Agilent HP-5MS色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm）：安捷伦科技（中国）有限公司；ZHH-Z1214型超净工作台：上海智城分析仪器有限公司；YXQ-SG41-280-B型高压蒸汽灭菌锅：上海医用核子仪器厂；AR323CN型电子天平：奥豪斯仪器有限公司；WFJ2000型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器设备有限公司；ZHWY2102C型恒温振荡培养器：上海智城仪器厂；安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虾壳米醋的工艺流程及操作要点

虾壳米醋的酿制工艺流程参考杨馨悦等[15]的方法并稍作改进。

操作要点：

大米糊化：大米粉碎至通过80目筛，去除结块后，将大米粉缓缓加入水中，搅拌，煮至淀粉完全糊化。

液化：加入0.5%的耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后，在95 ℃条件下酶解2 h。

糖化：温度降至62 ℃后，加入0.7%的糖化酶，然后将料液转移至恒温培养箱中，45 ℃酶解6 h。

高活性干酵母活化：在35～38 ℃无菌蒸馏水中加入10%干酵母和0.2%白砂糖，充分搅拌，确保酵母完全溶解，盖上保鲜膜在35～38 ℃条件下水浴活化20～30 min。

酒精发酵：高活性干酵母活化后，按料液的3‰比例接种到糖化液中，同时添加2%黑曲霉细胞裂解液，混匀后置于38 ℃的恒温培养箱进行酒精发酵。酿酒酵母无氧发酵期间会不断产生气泡，因此每隔一段时间需排出瓶中的气体，当料液变澄清，不再有气泡冒出且酒精度不再上升时，即酒精发酵完成。

醋酸菌活化：巴氏醋酸杆菌AS1.41接种于醋酸菌液体培养基中，在30 ℃条件下恒温培养至OD600nm值＞0.8。

醋酸发酵：醋酸菌活化后接种到发酵液中，置于培养箱中34 ℃、180 r/min醋酸发酵。当酸度不再增加或缓慢增加时，即醋酸发酵完成。

过滤：醋酸发酵完成后使用滤布对醋液进行粗滤得到米醋。

虾壳米醋制备：分别在大米糊化（样品1）、糖化（样品2）、酒精发酵（样品3）、醋酸发酵（样品4）阶段按虾壳∶大米=1∶4（V/V）添加虾壳，在醋酸发酵结束后的米醋（样品6）按虾壳∶大米=1∶4（V/V）添加虾壳28 ℃浸泡6 h（样品5）制备虾壳米醋。

1.3.2 理化指标的测定方法

虾青素测定方法：参考文献[16-17]的方法并修改，取1 mL冷冻干燥后的醋样使用流动相复溶，离心后用0.22 μm的有机系微孔滤膜过滤。

色谱条件：Kromasil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈；流速1.0 mL/min；进样量10 μL，检测波长475 nm，柱温25 ℃。

标准曲线的绘制：称取虾青素标准品10.3 mg置入烧杯中，使用乙腈溶解配制成质量浓度为100 μg/mL的虾青素标准溶液，并将其分别稀释至1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL，使用高效液相色谱仪进行检测，得到峰面积（y）与虾青素质量浓度（x）之间的标准曲线回归方程：y=0.195 2x-0.283（相关系数R2=0.999 8）。

总多酚、总黄酮含量：参考翟淑红等[18]的方法测定；DPPH自由基清除能力：参考李诗颖等[19]的方法测定；羟基自由基清除能力：参考王征帆等[20]的方法测定。

1.3.3 挥发性风味物质测定

参考王超等[21]的方法测定样品中的挥发性风味成分。

1.3.4 感官评定

随机抽取10名评分员（5男5女）组成感官评定小组，对米醋的口感、香气、形态、色泽按照GB 18187—2000《酿造食醋》进行评价和描述，评定标准见表1[22]，取10人的平均分，满分为100分。进一步按照参考文献[23]提出的筛选方法评定食醋滋味，以下5种水溶液作为“滋味”标准：甜味（蔗糖35 g/L）、鲜味（谷氨酸钠0.6 g/L）、咸味（氯化钠2 g/L）、酸味（乳酸1.65 g/L）、苦味（L-异亮氨酸5 g/L）。

表1 虾壳米醋感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of crayfish shell rice vinegar

2 结果与分析

2.1 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋中虾青素含量的影响

不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋中虾青素含量的影响见图1。由图1可知，在大米糊化过程中添加虾壳（样品1）的虾壳米醋中虾青素含量最高，为0.315 mg/L，显著高于在醋酸发酵过程添加虾壳（样品4）和米醋浸泡虾壳过程（样品5）（P＜0.05）；高于糖化过程添加虾壳（样品2）和酒精发酵过程中添加虾壳（样品3），但不显著（P＞0.05）。结果表明，在米醋发酵的大米糊化阶段添加虾壳对虾壳中虾青素的提取效果最好。

图1 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋虾青素含量的影响Fig.1 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on astaxanthin content of crayfish shell rice vinegar

2.2 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋中总多酚、总黄酮含量的影响

不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋的总多酚、总黄酮含量的影响见图2。由图2可知，在米醋不同发酵阶段添加虾壳，虾壳米醋的总多酚含量呈下降趋势，而总黄酮含量呈先上升后下降的趋势，但与没有添加虾壳的米醋相比均有显著性提高（P＜0.05），总多酚含量提高了90.21%～219.09%，总黄酮含量提高了34.09%～102.83%；其中，在糊化阶段添加虾壳所制备的虾壳米醋中（样品1）总多酚含量最高，在糖化发酵阶段添加虾壳制备的虾壳米醋（样品2）总黄酮含量最高，分别为81.78 mg/L和25.05 mg/L。

图2 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋总多酚及总黄酮含量的影响Fig.2 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on the contents of total polyphenols and total flavonoids of crayfish shell rice vinegar

2.3 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋DPPH、羟基自由基清除率的影响

不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋DPPH、羟基自由基清除率的影响见图3。由图3可知，在米醋不同发酵阶段添加虾壳后，虾壳米醋DPPH、羟基自由基清除能力与空白米醋相比均有显著性提高（P＜0.05），其中在糊化阶段添加虾壳所制备的虾壳米醋（样品1）DPPH清除率最高，为95.87%，比没有添加虾壳的米醋的DPPH自由基清除率（63.76%）高32.11%。在糖化发酵阶段添加虾壳制备的虾壳米醋（样品2）羟基自由基清除率最高，为66.35%，比没有添加虾壳制备的米醋羟基自由基清除率（52.85%）高13.50%。

图3 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋DPPH及羟基自由基清除率的影响Fig.3 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on DPPH and hydroxyl radical scavenging rate of crayfish shell rice vinegar

2.4 不同发酵阶段添加虾壳米醋挥发性成分分析

由表2可知，6种米醋中共检测出挥发性香气成分32种，其中酸类6种、醇类2种、酯类15种、醛酮类7种、其他物质2种。醇类挥发性物质含量占比最高，其次是酯类，酸类和醛酮类挥发性物质含量占比较低。酸类物质中样品1含量最高（18.56 mg/L），样品5含量最低（1.51 mg/L）；酯类物质中样品1含量最高（46.09 mg/L），样品4含量最低（13.25 mg/L）；醇类物质中样品2的含量最高（153.75 mg/L），米醋含量最低（56.1 mg/L）；醛酮类物质中样品2含量最高（15.35 mg/L），样品3含量最低（6.64 mg/L）。辛酸稀释后呈水果香气[24]，在样品2、样品4和样品3中的含量高于空白米醋、样品5和样品1，表明糖化、酒精发酵、醋酸发酵阶段添加虾壳能够促进辛酸的产生，而在糊化阶段添加虾壳和米醋浸泡虾壳过程对辛酸的产生影响较小。己酸乙酯具有果香和酒香香气[25-26]，在样品1的含量高于米醋及其他样品醋，表明在糊化阶段，虾壳的添加促进了己酸乙酯的产生，而在糖化、酒精发酵、醋酸发酵阶段和浸泡阶段，虾青素的产生抑制了微生物代谢[27]，导致己酸乙酯和癸酸乙酯产量减小。苯乙醇在添加虾壳后的米醋中的含量均高于米醋，表明虾壳的添加促进了苯乙醇和苯甲醛的生成。在添加了虾壳后，增加了醋中的酸类风味物质和醇类风味物质的产生。在糊化、糖化阶段添加虾壳后能够增加醋中酯类化合物的生成。

表2 不同发酵阶段添加虾壳对虾壳米醋挥发性成分的影响Table 2 Effects of crayfish shell addition at different fermentation stages on volatile components of crayfish shell rice vinegar

2.5 不同发酵阶段添加虾壳的虾壳米醋感官评价

不同发酵阶段添加虾壳的虾壳米醋感官评价结果见图4。

图4 不同米醋样品的感官评分（A）与滋味评价雷达图（B）Fig.4 Sensory score (A) and taste evaluation radar diagram (B) of different rice vinegar samples

由图4（A）可知，在大米糊化阶段添加虾壳酿制的样品1感官评分最高，其次为糖化阶段添加虾壳酿制酿制的样品2。由图4（B）可知，空白米醋的醋酸气味较浓，难以分辨食醋中其他香气成分。食醋的滋味以酸味为主，甜味和鲜味次之，最后是温和的咸味和苦味[28]。由于米醋中醋酸含量较高，导致其酸味刺激性较强，而添加虾壳后的米醋中除醋酸外，其他有机酸含量较高，酸味较米醋更柔和，鲜味和甜味分值都高于米醋。米醋和样品5的感官差异较小。

3 结论

在米醋酿制的不同阶段添加虾壳酿制米醋并研究了米醋的风味和功能性，观察虾壳的添加对食醋品质、风味和抗氧化活性的影响。

在不同发酵阶段添加虾壳对米醋的风味和抗氧化活性的影响具有一定的差异。从功能性方面来看，在发酵过程中添加虾壳后，其抗氧化活性明显高于空白米醋。其中，在大米糊化阶段添加虾壳酿造米醋，其总多酚（81.78 mg/L）、虾青素含量（0.315 mg/L）以及DPPH自由基清除率（95.87%）均为最高。而用米醋浸泡虾壳法酿制米醋，其总多酚（48.8mg/L）、总黄酮（17.3 mg/L）以及虾青素含量（0.15 mg/L）、DPPH自由基清除率（83%）和羟基自由基清除率（52.8%）均最低。从风味方面来看，在添加虾壳后，酸类和醇类风味物质含量较米醋相比显著增加，其中在糊化阶段添加虾壳酿制的样品1产生的酸类和酯类风味物质含量最多，分别为酸类18.56 mg/L，酯类46.09 mg/L，而在糖化阶段添加虾壳酿制酿制的样品2产生的醇类风味物质含量最多，为153.75 mg/L。综上所述，在大米糊化阶段添加虾壳酿造米醋，对米醋品质的影响最大，其抗氧化活性、虾青素的含量以及挥发性风味物质的含量均高于其他样品。

本研究采用了GC-MS和HPLC对不同米醋中的挥发性风味物质以及功能性成分进行分析，重点地研究了不同发酵阶段添加虾壳对米醋的风味物质成分和功能性物质的产生，为后续优化液态酿造功能性米醋的发酵工艺提供理论指导。