可视化微观显影对二氧化碳膨胀乙醇提取葡萄籽油的过程分析

黄林洁, 谢雨波, 李红娜, 李明越, 周 丹, 邓 刚

(浙江省特色经济植物生物技术研究重点实验室；浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界范围内广受欢迎的大宗水果之一，全球年消费量接近8 000万t，其中80%以上的葡萄被用于生产葡萄酒、果酱等，产生葡萄籽约300万t[1]。葡萄籽残渣除了可用于土壤改良剂和饲料外，还是一种理想的油脂提取原料。葡萄籽富含油脂[2]，不饱和脂肪酸高达85%[3]，其主要成分亚油酸是人体必需脂肪酸[3]。传统葡萄籽油的提取方法有机械压榨法、有机溶剂萃取法[3]等，设备成熟、操作快捷、工艺简单，但存在能耗高、溶剂使用量大等缺点。近年来，随着可持续发展政策的推进，发展绿色经济已经成为一个重要趋势，Li等[4]对一种新型环境友好型提取溶剂，二氧化碳膨胀乙醇(CO2-Expanded Ethanol, CXE)进行了研究，优化了提取葡萄籽油的操作条件，得率高达13.6%，提取效率及产品品质均优于传统提取方法，可作为有机溶剂的替代介质[5]。

然而，CXE是一种复杂的加压流体，由非极性的超临界或亚临界状态的CO2和极性的乙醇混合组成[6，7]，其提取机理受多种因素影响，一方面，流体的溶解性能和渗透扩散能力易受温度、压力、CO2摩尔比等因素控制[8-10]，另一方面，高压条件(40 MPa以上)下渗透到内部的流体可造成物料微观结构碎裂或局部坍塌，进而促进或阻碍特定物质由内向外的释放。因此，传统方法如基于过程数据的动力学分析或基于模型的热力学理论研究，用于阐述加压流体的复杂提取机制均非常困难。近年来随着光电子、图像加工处理等技术的迅猛发展，使得对微细颗粒形态结构进行可视化显影(visualization)成为可能，在食品加工、生物分离及植物生理等领域均有广泛应用。以电子束为介质的扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy, SEM)技术，可在纳米尺度上来研究微观结构的变化，Khadhraoui等[11]用场发射扫描电镜观测到50 μm的苦橙叶腺体在超声波作用下的破损状态，Zhang等[12]通过聚焦离子束扫描电镜观察了蒸压和超声波处理后杏仁粉中粒径15 μm的颗粒内部多孔化(cavitation)。进一步结合染色技术对物料内部特定物质染色后，借助荧光观测进行定位分析，尤其是借助于以激光为光源的激光共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy, CLSM)对物料内部聚焦成像，能够以非破坏性的方式观察到内部三维空间结构中目标物质的动态变化和传质过程，如蓖麻籽粉中的脂质体形态变化[13]、莴苣嫩茎中的果胶从细胞壁分解至细胞间隙[14]、刺梨果皮中的甜菜素和酚类化合物从细胞内部释放到细胞间隙[15]。由此可见，微观显影技术可作为一种直观的分析方法引入到加压流体提取过程的研究中，追踪目标成分在物料内部的空间分布，监测传质过程中的释放机制，从而阐明提取机理，为传统动力学、热力学理论研究提供参考。

本研究在CXE提取葡萄籽油过程中，通过扫描电子显微镜观测了提取前后葡萄籽物料内部的微观结构，对内容物葡萄籽油进行了特异性染色，构建了荧光定量法对葡萄籽油提取的三阶段进行了过程分析，利用激光共聚焦显微镜动态分析了提取过程中葡萄籽油的空间分布变化，并直观地评价了不同提取方法的能力。

1 材料与方法

1.1 材料

红葡萄(Vitisvinifera)于2017年9月，在中国新疆省吐鲁番市(43.15° N，88.87°E，海拔878 m)采摘。去除葡萄果肉、果皮等，将葡萄籽在55℃下干燥48 h，磨成葡萄籽粉末，过40目标准筛，选取粒径范围为350～550 μm的颗粒进行后续的研究，真空密封后置于-20 ℃避光保存。

1.2 仪器与试剂

S-4800场发射扫描电镜，Discovery V12荧光显微镜，TCS SP5激光共聚焦显微镜，HELIX超临界天然产物萃取装置，CM 1950冷冻切片机。

5 μg/mL尼罗红的PBS染液(pH 7.4)；CO2气体(纯度≥99.9%)；亚油酸标准品(纯度≥95%)；正己烷、乙醚、乙醇等其他试剂均为分析纯。

1.3 扫描电镜观察葡萄籽粉末的微观结构

称取30 g葡萄籽粉末，以正己烷为溶剂，在75 ℃下索式提取300 min后，取出葡萄籽粉样品，55 ℃真空干燥后，用Tissue-Tek OCT包埋剂对样品进行包埋，冷冻至-20 ℃，切片，厚度设为100 μm，固定至导电胶，表面镀金，采用扫描电镜对有机溶剂提取前后的葡萄籽粉微观结构进行观测。

1.4 葡萄籽油的特异性染色及荧光定量

模拟物料的制备：称取50 g葡萄籽粉末，乙醚回流2 h脱脂，再经水和乙醇混合液(1∶1)浸提2～3次，脱除糖、蛋白等极性成分，真空干燥，得到不含内容物的葡萄籽粉净颗粒(net particle)。取4份0.5 g的净颗粒，1份作为对照，其余3份分别与1 mL的5 mg/mL植物蛋白、亚油酸、葡萄籽油进行混合，真空浸渍，制备得含3类物质的模拟物料。

荧光观测：包埋切片条件同1.2，将4个模拟物料都与10 μL的尼罗红染液混合，暗室低温静置10 min。使用荧光显微镜在激发波长488 nm，吸收波长为528～600 nm下进行扫描观测。

荧光定量：进行了多批次正己烷提取实验，实验条件同1.2，第一批次提取时间为30 min，每批次间隔30 min，最后一批次为270 min。每批次得到的提取液经旋转蒸发脱除溶剂，得到葡萄籽油，称质量，计算含油量(SOW)，重复3次取平均值；每批次提取后残留的物料粉末，经包埋、冷冻切片、染色后，用荧光显微镜进行观测。使用Image J (National Institutes of Health)图像数据分析软件标记200 μm×150 μm视野范围内的荧光，计算荧光面积占比(Fluorescence area fraction, FAF)。由于冷冻切片厚度一致，葡萄籽粉末油含量与FAF值呈线性相关，可由公式来计算荧光法得到的含油量(SOF)：

SOF=0.14FAF+0.1

为验证新构建荧光定量法的准确性，将该法与传统称重法进行相关性分析，计算相关系数R值。

1.5 CXE提取及荧光观测葡萄籽油提取过程

称取30 g葡萄籽粉末与等体积玻璃珠混匀后，装入超临界天然产物萃取装置，将超临界CO2(7.4 MPa、314 K)和乙醇混合形成CXE流体(摩尔比0.3)，对物料进行提取，定时取样，旋转蒸发除去乙醇，得到葡萄籽油，称重，计算葡萄籽油的提取得率和速率并绘制曲线。

分别对各阶段的葡萄籽粉进行了取样，以提取前葡萄籽粉原料为对照样品，经包埋、冷冻切片、染色后对不同阶段的样品进行荧光观测。

1.6 激光共聚焦显微镜观察葡萄籽油提取的动态过程

取CXE不同提取阶段残留的葡萄籽粉物料，分别将粉末颗粒的中心区域A、浅表区域B、外表区域C进行包埋切片，厚度为50 μm。染色后，利用激光共聚焦显微镜在20倍物镜下对样品进行观测，采用激发波长488 nm，接收波长550～600 nm，利用Z-stack扫描逐层收集Z轴方向上的荧光图像，在连续扫描模式下获得2D图像，在最大强度模式下利用LAS-AF软件生成三维复合荧光图像。

超临界CO2提取采用与CXE相同装置，设定压力为25 MPa，温度为313 K，提取时间长为180 min。

2 结果与分析

2.1 扫描电镜对葡萄籽粉末内部微观结构的观测

图1为正己烷提取葡萄籽油前后粉末颗粒内部微观结构的SEM图像。提取前的葡萄籽颗粒的内部呈现均匀规则、紧凑的蜂巢状多微腔结构，微腔为拟球形，平均直径约为25 μm，多数微腔中存在大量的内容物；而葡萄籽物料经有机溶剂完全提取后，其内部微观结构发生了显著的变化，微腔结构呈现松散、不规则性，微腔直径变大，表明溶剂提取造成了物料骨架结构的严重破损或坍塌，内容物已被提取殆尽。基于SEM的观测虽然可以了解葡萄籽物料内部的微观结构及存在的内容物，但并不能辨识内容物的化学组成。

图1 葡萄籽粉末颗粒内部微观结构SEM显影 (标尺为40 μm)

2.2 葡萄籽油的特异性染色及荧光定量方法的构建

图2 葡萄籽粉颗粒的尼罗红特异性染色(标尺为50 μm)

为了进一步探究葡萄籽粉微观结构微腔中内容物的组成，首先需要构建一种葡萄籽油特异性染色方法。如图2所示，葡萄籽粉先经乙醚脱脂、水-乙醇溶液脱蛋白得到无内容物的葡萄籽粉净颗粒(图2a)，净颗粒分别与植物蛋白、葡萄籽油主要成分亚油酸及葡萄籽油混合浸渍制成3种模拟物料(图2b～图2d)，采用尼罗红染料进行染色，通过荧光显微镜进行观测。净颗粒及含亲水蛋白质的模拟物料，染色后未发出荧光，而含亚油酸及葡萄籽油的模拟物料则呈现强烈的金黄色荧光。尼罗红是一种苯并吩恶嗪类的疏水性染料[16]，能与脂类等极性物质特异性结合而发出金黄色荧光[17]，但在亲水环境中几乎是完全荧光淬灭(quench)的，这一特性可以用来监测提取过程中物料内部油脂的存在情况。

基于尼罗红对葡萄籽油的特异性染色的特性，进一步探讨了荧光定量油脂的可行性。图3分别用荧光定量和溶剂萃取法测定了正己烷提取葡萄籽油过程中，不同时间点物料中的油脂含量，并对2种方法结果进行了线性相关性分析。结果表明，2组数据的相关系数高达0.982，呈现严格的正相关，表明新构建的荧光定量方法的准确性与传统的萃取称重法相当，均能准确测定提取过程中物料颗粒中葡萄籽油的含量，为直观地观察葡萄籽油提取的动态过程提供新的思路。

2.3 二维荧光显影葡萄籽油的CXE提取过程分析

Eckert等[5]优化了CXE提取葡萄籽油的工艺条件，在压力7.4 MPa、温度314 K、CO2摩尔分率0.3的最优条件下进行了提取实验，提取呈现典型的溶剂提取三阶段过程[18]：恒速期(0～35 min)、减速期(35～80 min)、扩散期(80～120 min)。对提取前葡萄籽粉原料及3个阶段中的典型物料进行取样，分别在明场(bright-field)和荧光场(fluorescence-field)视野下进行观测。由图4可知，明场条件下，可以观察到各阶段葡萄籽粉物料内部的多微腔结构，虽经加压液体提取，但其微腔结构基本保持完整。荧光场条件下提取前葡萄籽粉原料呈现高亮的金黄色，荧光几乎占满视野，表明葡萄籽原料富含充足的油脂。经三阶段的提取，荧光亮度显著减弱，荧光占比由初始的96.4%逐渐降至5.1%，与之相对应的油得率在恒速期均匀上升至9.53%，在减速期则缓慢升至13.6%，并在扩散期保持恒定。实验结果充分说明了二维荧光显影能直观地观测提取过程中葡萄籽油含量的变化，但由于无法了解油脂在物料内部的空间分布及状态，尚不能解释在不同提取阶段葡萄籽油的释放速率的差异。

图4 葡萄籽油提取各阶段的荧光观测 (标尺为100 μm)

2.4 三维激光共聚焦显影对葡萄籽油提取过程的动态分析

葡萄籽粉颗粒可视为一个拟球体，半径约为225 μm，如图5a所示，分别对颗粒中心A区域、浅表层B区域及外表层C区域进行切片、染色，采用激光共聚焦技术进行显影，考察了CXE提取不同阶段中的油的空间分布及量的变化，结果如图5b所示。提取前，原料粉末颗粒的微腔中富含葡萄籽油，FAF值接近100%；在提取的恒速阶段，相比于颗粒中心A区域，B和C区域的FAF值显著减小，表明吸附在外表层及存在于浅表层的油极易被提取，并以恒定速率释放至CXE流体中，中心区域含油的微腔开始因加压溶剂的渗透作用而膨胀。进入减速阶段，中心区域的FAF值变化不大，微腔结构体积进一步变大，外表层和浅表层的FAF值已降至很低的水平，分别为13.1%和8.9%，提取速率显著下降。在扩散阶段，葡萄籽油从中心区域扩散至外表层，进而释放至溶剂相，中心区域的含油量很低，FAF值仅为7.9%，而外表层和浅表层的油也基本被提取殆尽，但由于传质推动力较小，葡萄籽油的得率基本保持不变。三维激光共聚焦显影技术可以用于观测在加压液体提取过程中油的空间分布，并对油的释放过程进行动态分析，进而阐明CXE不同提取阶段的作用机制。

图5 CLSM对CXE提取葡萄籽油的过程分析

2.5 三维激光共聚焦显影对不同方法提取葡萄籽油过程的比较分析

传统分析方法多从宏观角度上通过整体物料的提取得率来评测提取方法，三维激光共聚焦技术可以观测到微细物料颗粒内部目标成分的空间分布，观测了正己烷、超临界CO2和CXE这3种溶剂完全提取葡萄籽油后粉末颗粒内不同部位的油分布，结果如图6所示。从粉末的中心区域来看，超临界CO2提取后物料中尚含有大量葡萄籽油，FAF值约为27%，显著高于正己烷和CXE提取；颗粒外表区域经提取后，正己烷和CXE提取残留物料中油含量极低，FAF值分别为7.9%和5.3%，显著低于超临界CO2提取。结果表明，CXE流体较有机溶剂而言，具有更强的渗透能力，提取得率略高于正己烷提取，而同为加压流体的超临界CO2，其提取得率则低于其他2种方法。总而言之，三维激光共聚焦技术能够直观地显示不同方法下油被溶剂提取的程度及过程，进而分析溶剂的极性、渗透能力等相关影响因素，可更为客观地比较不同方法的提取能力。

图6 不同方法提取葡萄籽油的CLSM显影比较(标尺为100 μm)

3 结论

CXE和超临界二氧化碳等加压流体属于环境友好型的绿色溶剂，但提取机制相对比较复杂，本研究尝试构建了一套可视化微观显影技术，考察了在CXE提取过程中物料颗粒中油的空间分布，对其释放过程进行动态分析，初步阐明了CXE提取葡萄籽油的机理，并从微观角度直观地比较了不同方法的提取能力。现代食品工业已进入依托大数据和人工智能的快速发展阶段，引入一些前沿的显微成像技术，可有效地监测加工处理过程中物料特性及主要成分的变化，追踪目标成分在空间上的分布及迁移，最终有望形成一套实时准确的原位监测方法，可促进实际的生产操作。