壶瓶碎米荠富硒油脂理化特征及体外抗氧化活性的研究

牛茵茵， 唐巧玉， 周大寨， 罗兴武， 罗 凯， 周毅峰

(生物资源保护与利用湖北省重点实验室1，恩施 445000)(湖北民族大学生物科学与技术学院2，恩施 445000)

硒是人体所必需的微量元素之一，具有抗癌、抗炎症等功效，缺硒会对重要的脏器造成功能紊乱、免疫力下降等影响[1-3]，从而引发多种疾病；David等[4]也证明了补充一定的抗氧化剂对降低心血管疾病有一定的作用，而维持内源性抗氧化活性更重要的是添加硒这样的微量元素。

壶瓶碎米荠(Cardaminehupingshanensis)，十字花科属，超聚硒植物,一种可食用的野生蔬菜[5]，其各个部位都含硒，叶片硒含量高达1 437 mg/kg[6,7]，它可参与机体抗氧化过程，作用于某些癌症等[8]，因其具富硒的优势，使其成为硒研究的热点。此外，壶瓶碎米荠中可提取分离含硒的组分，硒蛋白具有缓解疲劳的功效，硒黄酮具有抗凝血功能[9,10]；曹斌[11]鉴定分离纯化恩施碎米荠中的含硒蛋白以及对该蛋白的结构表征，证实了这种硒蛋白具有抗氧化功效；张春燕等[12]对含硒粗黄酮进行体内体外抗氧化测定，结果表明含硒粗黄酮比普通黄酮的抗氧化性强；壶瓶碎米荠的研究也涉及转录组学和蛋白组方面的研究，周毅峰[13]通过转录组差异分析了壶瓶碎米荠硒代谢途径，证明了硒化是壶瓶碎米荠耐硒的重要途径；罗金华[14]克隆壶瓶碎米荠GST-u4基因，并证明了GST-u4基因表达产物对硒酸根、亚硒酸根和谷胱甘肽具有亲和性，推断谷胱甘肽对硒酸根和亚硒酸根熬合作用也是重要的耐硒机制。这些研究结果为以茎、叶为原料的植物硒产品开发奠定了基础。但目前以壶瓶碎米荠种子为原料的硒产品研发鲜见报道，本研究以壶瓶碎米荠种子为原料，分离提取其油脂，分析其含硒水平及功效，进一步拓宽了超聚硒植物壶瓶碎米荠开发利用的渠道。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：壶瓶碎米荠种子采集于湖北省恩施市，收集后除杂脱水冷藏于-20 ℃冰箱，取用时将其粉碎过60目筛烘干。

试剂：焦性没食子酸、三氯甲烷、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、无水乙醇、乙醚、异丙醇、硫代硫酸钠、无水硫酸钠、抗坏血酸、冰乙酸、酚酞、氢氧化钾，分析纯；DPPH(分析纯)；硒标准品：GSB-04-1751-2004；碘化钾(分析纯)；环己烷(分析纯)。

1.2 仪器与设备

50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取头、手动SPME进样器，顶空瓶(15 mL)，TU-1901紫外可见分光光度计，6890-5973 GC-MS联用仪，MARS 5微波消解仪，AFS-9760双道原子荧光光度计，080S超声波清洗机，GZX-9420 MBE电热恒温鼓风干燥箱，H2050R离心机。

1.3 方法

1.3.1 壶瓶碎米荠油脂的提取

将保存于冰箱的种子60 ℃烘干后，粉碎过60目筛，称取一定量粉末采用索氏提取法，加入石油醚至接收瓶的1/2，60 ℃回流提取4～6 h，挥干溶剂，制得种子油，油称重并置于-4 ℃冰箱避光保存备用。

式中：m2为圆底接收瓶和所提油脂的总质量/g；m1为烘干恒重的圆底接收瓶的质量/g；m为称取的壶瓶碎米荠种子粉末的质量/g。

1.3.2 壶瓶碎米荠油脂理化特征分析

1.3.2.1 壶瓶碎米荠油脂理化特性

过氧化值：参照GB 5009.227—2016；碘值：参照 GB/T 5532—2008；酸价：参照GB 5009.229—2016。

1.3.2.2 硒含量的测定

参考张春燕等[12]采用微波消解-原子荧光分光度法测定硒含量。

1.3.2.3 壶瓶碎米荠油脂总酚含量测定

取1 mL样品油分3次，间隔0.5 h，添加甲醇5 mL，超声提取1.5 h，离心后取上清液用甲醇定容至25 mL得到待测样品。参考程哲等[15]采用Folin-Ciocalteu法测定油脂中总酚含量。

1.3.2.4 壶瓶碎米荠油脂组成成分分析

样品甲酯化参考崔永宁等[16]的方法。

GC条件:进样口温度250 ℃，分流比：20∶1，载气为氦气，恒定流速为1.2 mL/min，升温程序：初始温度60 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min。

MS条件：全扫描模式，扫描范围为35～440 u，离子源为EI源，电子能量70 eV，四级杆：150 ℃，离子源温度为230 ℃。

1.3.2.5 壶瓶碎米荠油脂的挥发性成分测定

参考牟迪等[5]的方法，采用 HS-SPME-GC-MS法进行测定。

GC条件：DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，纯度>99.999 %，流速为1 mL/min。升温程序：起始温度为40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min，以10 ℃升温至250 ℃，保持5 min。

MS条件：接口温度250 ℃，离子源为EI，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四级杆150 ℃，扫描范围35～450 amu。

1.3.3 壶瓶碎米荠油脂抗氧化活性的测定

参考曾琳等[17]和颜飞翔等[18]的方法测定对DPPH、超氧阴离子自由基清除率。

1.3.4 统计分析

使用统计软件SPSS 16.0和Excel 2016分析统计数据,用OriginPro 9.1对数据进行图形处理分析。

2 结果与分析

2.1 壶瓶碎米荠油理化特征

壶瓶碎米荠油脂理化特征见表1，出油率(31.00±2.85)%，与大豆出油率(18.00%～22.00%)和橄榄出油率(18.22%～23.50%)相比，可发展为油料作物。碘值为(112.04±2.40) g/100 g，为半干性油，可知其油脂含不饱和脂肪酸高；壶瓶碎米荠种子油的过氧化值为(0.12±0.02) g/100 g，符合国家标准，有研究表明含硒可提高其抗氧化性能，使得过氧化值降低[19]；酸价为(4.83±0.30) mgKOH/g，略高于国家标准，可能是由于油脂未经过精炼而导致酸价偏高，需进行加工处理；硒含量为(8.439±1.12) mg/kg，符合湖北省地方富硒标准，相比较普通植物油，含硒油抗氧化性强具备广阔的市场前景；总酚含量为(1.428±0.032) mg/mL，高于橄榄油中总酚的含量[20]。

表1 壶瓶碎米荠油理化特征

2.2 壶瓶碎米荠油脂成分分析

壶瓶碎米荠油脂总离子流图如图1所示，组成成分见表2，主要含脂肪酸类8种、醇类1种，质量分数分别为97.88%、2.12%，不饱和脂肪酸质量分数达到了92.49%， 略高于花生油(74.9%)和大豆油(81.17%)，略低于菜籽油(94.98%)[21]，且不饱和脂肪酸可以调节血脂，改善心血管疾病[22]，此外壶瓶碎米荠油脂中亚油酸、亚麻酸质量分数为27.89%。宋亚蕊[23]的研究表明，硒量增加时，茶油不饱和脂肪酸含量增加，当硒质量分数达到0.074 5 mg/kg时，亚油酸、亚麻酸的含量显著增加；由此可推断壶瓶碎米荠油脂中所含的不饱和脂肪酸质量分数高于90%可能与硒含量有关。其中植物甾醇(2.12%)质量分数高于菜籽油(0.73%)，它是一种天然存在的活性成分[24]，相关报道显示富硒可能对植物甾醇含量造成影响。壶瓶碎米荠油脂芥酸含量过高，高芥酸能引起心肌脂肪沉积, 引发心肌炎疾病。

图1 壶瓶碎米荠油脂总离子流图

表2 壶瓶碎米荠油脂GC-MS鉴定结果

2.3 壶瓶碎米荠油脂挥发性成分分析

壶瓶碎米荠油脂挥发性物质总离子流图见图2，共检测到56种挥发性物质见表3，主要包括苯类(13种)、烃类(26种)、酯类(5类)、醇类(3种)、其他(9种)，质量分数分别为14.35%、29.06%、32.15%、3.20%。酯类含量最高，其次是烃类，占总挥发性成分的29.06%；同时其中所含的异硫代氰酸酯类化合物是一类重要的植物化学物质，有不同程度的抗癌作用, 能够有效地预防饮食中多种致癌物(多环芳烃、杂环胺和亚硝胺)引起的DNA损伤和癌症，此外对真菌摄取氧有一定影响，从而影响ATP的合成[25]；紫罗兰酮类化合物也有较强的抗肿瘤活性[26]。

图2 壶瓶碎米荠油脂挥发性物质总离子流图

表3 壶瓶碎米荠油脂挥发成分分析结果

续表3

2.4 壶瓶碎米荠油脂的体外抗氧化活性分析

2.4.1 清除超氧阴离子自由基能力

由图3可知，壶瓶碎米荠油脂对超氧阴离子自由基有明显的清除效果，存在剂量效应关系；壶瓶碎米荠油脂与维生素C两者质量浓度较小时，清除效果有显著性差异(P<0.05)，当壶瓶碎米荠油脂的质量浓度达到2.5 mg/mL，维生素C质量浓度达到1.25 mg/mL时，没有显著性差异。在0.156～1.250 mg/mL质量浓度时，壶瓶碎米荠油脂的浓度与超氧阴离子自由基清除率呈显著的线性相关，线性相关系数为0.990 2，线性相关回归方程为y=58.040x-7.527(x为壶瓶碎米荠油脂质量浓度，y为超氧阴离子自由基

注：不同字母表示有显著性差异(P<0.05)，下同。图3 不同浓度壶瓶碎米荠油脂和维生素C对超氧阴离子清除率比较

清除率)。总体上看，在质量浓度为0.156～5.000 mg/mL时，呈非线性的二次函数相关关系，方程为y=-8.027x2+60.442x-5.910(R2=0.982 7，x为壶瓶碎米荠油脂质量浓度，y为超氧阴离子自由基清除率)。这与维生素C对超氧阴离子自由基清除率基本一致，维生素C在0.156～2.5 mg/mL时，方程为y=-11.208x2+40.518x+65.08(R2=0.957 9)，x为维生素C质量浓度，y为超氧阴离子自由基清除率。

2.4.2 清除DPPH自由基能力

由图4可知，壶瓶碎米荠油脂质量浓度在2～40 mg/mL时对DPPH自由基的清除率有显著性差异(P<0.05)，质量浓度高于40 mg/mL时，清除率趋于平缓与质量浓度为80 mg/mL的清除效果没有显著性差异，达到了94%。在质量浓度为2.5～20 mg/mL时，壶瓶碎米荠油脂的质量浓度与DPPH自由基清除率呈显著的线性相关，线性相关系数为0.998 7，线性相关回归方程为y=3.315x-2.592x为壶瓶碎米荠油脂质量浓度，y为DPPH自由基清除率；总体上看，在质量浓度为2.5～80 mg/mL时，呈非线性的二次函数相关关系，方程为y=-0.031 7x2+3.747 2x-3.014 5(R2=0.995 9)，x为壶瓶碎米荠油脂质量浓度，y为DPPH自由基清除率。在供试浓度范围内，维生素C对DPPH自由基的清除率几乎接近定值，壶瓶碎米荠油脂对DPPH自由基的清除率逐渐接近维生素C清除率。

图4 不同浓度壶瓶碎米荠油脂和维生素C对DPPH清除率比较

3 讨论

实验结果表明壶瓶碎米荠油脂的酸价高于国家标准，后续研究可将样品油进行脱酸、脱蜡、脱臭等精炼工艺，改善品质，若理化指标达到国家标准即可作为未来开发利用新对象；实验所得油脂达到了富硒要求，可作为一种功能性油脂。但对于富硒油脂的抗癌，抗炎功能以及硒含量对壶瓶碎米荠油脂成分的影响需要深入探索；油脂脂肪酸主要成分中不饱和脂肪酸含量达到了92.49%，亚油酸和亚麻酸含量较高，这两种必需脂肪酸可维持毛细血管的正常以及保证正常生殖机能[27]，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等功能[28,29]；一些研究也证实了硒的存在会对油脂的理化特性造成影响，会降低酸价以及过氧化值[23]，提高油脂中不饱和脂肪酸的含量，使得油脂的品质提升，可见硒含量的摄入可改善油脂质量，未来可作为一种优化油脂的方法途径。针对壶瓶碎米荠油脂芥酸质量分数高达26.34%，可采用冷冻结晶预处理和尿素包合法降低芥酸含量[30]，也可采用基因调控干预培育转基因株[31]；HS-SPME-GC-MS检测到富硒油56种挥发性物质，其中所含的异硫氰酸苄酯(18.23%)，异硫氰酸异丁酯(8.96%)与分析超聚硒壶瓶碎米荠不同时期叶片挥发性物质所得到的主要成分一致[1]。

不饱和脂肪酸含量较高容易氧化，而壶瓶碎米荠油脂中虽然不饱和脂肪酸含量高，但其所含天然抗氧化成分(植物甾醇，总酚)高于其他植物油；此外研究表明，硒可参与新陈代谢，对作物的品质及其组成成分、功能性产生影响，刘娟等[32]研究证实了硒的存在会增加油脂天然抗氧化活性成分的积累，马小灵[33]证实硒含量增加提高茶油的抗癌、抗氧化性能；除此以外，硒本身具有抗氧化功能，两者结合协同作用，使得壶瓶碎米荠油脂抗氧化性能提高。对于硒在脂肪酸中存在的形态鲜见报道，只有早期出现硒化脂肪酸相关研究[34]，此方面还需继续探索。

4 结论

壶瓶碎米荠油脂出油率达到了(31.00±2.85)%，酸价为(4.83±0.30) mgKOH/g，过氧化值为(0.12±0.02) g/100 g，碘值为(112.04±2.40) g/100 g，硒含量为(8.439±1.120) mg/kg，总酚含量为(1.428±0.032) mg/mL油；油脂成分主要成分有9种，主要由不饱和脂肪酸构成，质量分数达到了92.49%，亚油酸、亚麻酸质量分数超过了20.00%；油脂挥发性物质主要包括苯类、烃类、酯类、醇类等。可知壶瓶碎米荠油脂是一种富硒、高不饱和脂肪酸的功能性油脂。

壶瓶碎米荠油脂具有较强体外抗氧化活性壶瓶碎米荠油脂质量浓度为0.156～1.250 mg/mL时，与超氧阴离子自由基清除率呈显著的线性相关，在质量浓度为0.156～5.000 mg/mL时，呈非线性的二次函数相关关系，这与维生素C清除率增长趋势相似；油脂质量浓度为2.5～20 mg/mL时，与DPPH自由基清除率呈显著的线性相关，质量浓度为2.5～80 mg/mL时，呈非线性的二次函数相关关系，且随着浓度的增大清除率逐渐趋于维生素C。由此可见，壶瓶碎米荠油脂对超氧阴离子自由基和DPPH自由基有较好的清除效果，具有较强的体外抗氧化活性。对于该富硒油脂的功能性研究以及安全性评价需要进一步地探索研究。