基于肿瘤新生抗原的抗肿瘤免疫治疗的研究进展

王雪春 朱影 黄常新

[摘要] 近年来，免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体免疫疗法（CAR-T）因其显著的治疗有效率，已成为某些肿瘤的“特效药”。新抗原作为肿瘤的特异性抗原，可激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL），发挥特异性抗肿瘤免疫应答。目前，下一代基因测序技术和质谱分析为新抗原的发现和鉴定提供了有利的技术支撑。基于新抗原的个性化肿瘤免疫治疗的突出疗效，在国内外实体瘤治疗大放异彩;其还可作为如T细胞受体修饰的T细胞治疗（TCR-T）治疗的特异性靶标;联合其他抗肿瘤疗法也显示出良好的发展前景。现就目前基于肿瘤新生抗原免疫治疗的研究进展做一综述。

[关键词] 肿瘤;免疫治疗;肿瘤新抗原;肿瘤疫苗

[中图分类号] R730.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）12-0188-04

[Abstract] In recent years， immune checkpoint inhibitors and chimeric antigen receptor T-cell （CAR-T） immunotherapy have become "specific drugs" for certain tumors because of their remarkable effective rate in treatment. As tumor-specific antigens， neoantigens can activate cytotoxic T lymphocytes （CTL） and exert specific anti-tumor immune responses. Currently， next-generation gene sequencing technology and mass spectrometry provide favorable technical support for the discovery and identification of neoantigens. Neoantigens-based personalized tumor immunotherapy has made a great splash in the treatment of solid tumors at home and abroad due to its outstanding efficacy. It can also serve as a specific target for T-cell receptor modified T-cell （TCR-T） therapy， for example. And the combination of it with other anti-tumor therapies has also shown a good development prospect. This paper reviews the current advances in the study of tumor neoantigens-based immunotherapy.

[Key words] Tumor; Immunotherapy; Tumor neoantigens; Tumor vaccine

据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症数据显示，中国癌症的新发例数和死亡例数占全球第一位[1]。近年来，以靶向药物和免疫治疗为代表的生物治疗迅猛发展，超越了传统的手术、放疗、化疗等治疗，成为肿瘤治疗发展的主流趋势。目前已有大量研究证实，利用新抗原制备的肿瘤疫苗，可激发机体自身抗肿瘤免疫效应，在肿瘤治疗中具备极大的应用前景。

1 新抗原的来源与意义

突变的发生和逐步累积被公认为是肿瘤启动和进展的主要机制，某些“非同義突变”会导致新抗原的产生[2]。新抗原是肿瘤特异性突变导致氨基酸序列改变形成的新表位，只存在于肿瘤组织，而不存在于正常组织，属于肿瘤特异性抗原。近年来研究发现，绝大部分新抗原是来自于非编码区突变，即蛋白翻译后的错误剪接组合和降解转运过程[3]，基于全外显子或信使RNA测序预测的新抗原肽，极少为质谱所证实。Prehn等[4]的体内实验表明，引起强烈肿瘤排斥的抗原更具有个体特异性。因此，与肿瘤相关抗原相比，新抗原具有更强的免疫原性及高度特异度，能激发机体特异性抗肿瘤免疫效应，成为精准肿瘤免疫治疗的特异性靶点。

较高的肿瘤突变负荷与改善肿瘤免疫治疗的生存率有关[5]，本团队的前期研究还证实某些肿瘤新抗原与生存期改善有关[6-7];并且，患者预后不仅与拥有的新抗原数量相关，新抗原质量与类型也影响着其临床抗肿瘤免疫效应[8-9]。

2 新抗原的发现与鉴定

过去常以cDNA文库鉴定新抗原，此方法费时费力[10]。下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）因其检测高效和技术成熟，已成为新抗原发现的重要手段，其简要过程如下：①利用全基因测序和（或）全外显子基因测序等技术对患者肿瘤组织及正常组织进行测序获取抗原谱;②肿瘤组织进行转录子测序;③选择肿瘤样品中非同义突变体;④预测与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分子亲和力;⑤体外合成抗原肽，验证免疫原性[11-12]。然而，目前常用的全外显子（即编码区）测序寻找肿瘤新抗原肽的准确性较低;并且由于每例患者的肿瘤新抗原肽不相同不通用，肿瘤细胞实际存在的免疫有效新抗原肽不多，而占绝大多数的弱免疫原性肽可导致免疫耐受、无能甚至免疫抑制，故需每例患者进行体外免疫学实验确定每条肽的免疫活性，这一过程非常费时繁琐。以上这些直接限制了个体化疫苗的临床推广应用。因此，快速、准确地发现肿瘤细胞内有效新抗原肽和提高弱免疫原性新抗原肽的免疫效应显得极为重要[13]，本团队研究发现，新抗原结构特性及新抗原肽与特异性T细胞之间的关系可帮助快速发现和鉴定新抗原[14-15]。1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

质谱分析手段的成熟为新抗原鉴定提供新思路，高分辨率质谱可直接鉴定肿瘤组织表面抗原肽。发表于Nature的研究表明，利用主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）肽组谱发现了95，500条与黑色素瘤相关抗原肽，并成功从中鉴定到11条体细胞来源新抗原肽[16]。质谱鉴定抗原肽的重要条件之一是获取MHC洗脱肽;免疫沉淀是获取MHC洗脱肽最常用的方法之一。技术流程：①MHC复合物通过免疫沉淀从肿瘤组织或细胞中分离;②充分洗涤除去未结合混合物;③应用酸性洗脱液分离来自MHC分子和抗体的抗原肽;④纯化肽段;⑤对纯化肽段进行质谱分析;⑥原始图谱对比蛋白质数据库获取真实存在蛋白质数据库[17-18]。此方法获取抗原肽的特异性较高，但操作复杂。弱酸洗脱法为另一种获取MHC洗脱肽的常用方法。利用低pH值可使MHC Ⅰ的轻链与 MHC Ⅰ重链分离，在短时间内直接从细胞膜上洗脱MHC肽[19]。相比免疫沉淀法而言，弱酸洗脱法所获取MHC洗脱肽假阳性率更高。两种方法都需要大量肿瘤组织，标本预处理较为困难复杂，鉴定所获取抗原肽数目庞大，影响临床应用。本研究团队目前致力于研究快速筛选基于质谱获取的新抗原肽方法，且颇具成效，极大缩短新抗原筛选时间。

此外，利用肿瘤共享数据库也可快速发现具有免疫原性的肿瘤新抗原肽。国内有研究者利用癌症基因组图谱 （the cancer genome atlas，TCGA）和癌症体细胞突变目录（catalogue of somatic mutations in cancer，COSMIC）数据库对9种常见的实体瘤进行分析，在20 d内成功鉴定出被自体外周血淋巴细胞识别的肿瘤特异性新抗原[20]。

3 基于肿瘤新抗原的抗肿瘤免疫治疗

经过验证的免疫原性MHC结合肽可进一步制备个性化肿瘤疫苗。国内有研究[21]利用iNeo-Vac-P01新抗原疫苗启动了一项单臂、开发临床试验，结果显示在纳入的22例晚期恶性肿瘤患者中，疾病控制率为71.4%，中位无进展生存（median progression-free survival，mPFS）为4.6个月，12个月总生存期（overall survival，OS）百分比约为55.1%，且纳入的2例胰腺癌患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）分别为4.2个月和6.3个月，OS分别为14.0+个月和13.3+个月，高于转移性胰腺癌一线化疗方案（奥沙利铂+伊立替康+氟尿嘧啶+亚叶酸钙，FOLFIRINOX）的PFS 为3.1个月，中位OS为 6.1个月[22]。

黑色素瘤具有较高的突变负荷，临床研究结果表明个性化新抗原疫苗可以在黑色素瘤患者中刺激持久的免疫反应，帮助控制转移性肿瘤[23]。Ott等[24]对6例手术切除后的ⅢB/C期和ⅣM1a/b期黑色素瘤患者进行新抗原疫苗接种，在20～32个月随访中，4例进入研究的ⅢB/C期患者仍没有复发，且2例ⅣM1b期疾病患者在接受pembrolizumab治疗后得到完全缓解。

与黑色素瘤不同，胶质母细胞瘤具有低突变负荷和低免疫性肿瘤微环境。 然而，Keskin等[25]对手术切除和放疗后的新诊断胶质母细胞瘤患者也进行多表位个体化新抗原疫苗接种，结果显示循环中肿瘤浸润性T细胞增加，且外周血的新抗原特异性T细胞可以迁移到颅内胶质母细胞瘤肿瘤中，为新抗原疫苗可能改变胶质母细胞瘤的免疫环境提供依据。

研究证实，肺癌存在多种免疫逃逸机制，高克隆新抗原与肺腺癌和鳞状细胞癌的无病生存率相关[26]。一项转移性肺癌患者进行单臂、多中心的新抗原疫苗临床研究（NCT02956551）表明，对入组12例患者总共进行85次多表位新抗原树突状细胞疫苗接种，尽管患者没有达到完全缓解，但疾病客观缓解率（objective response rate，ORR）为25%，疾病控制率达到75%，mPFS为5.5个月，中位生存期為7.9个月，且患者接受新抗原疫苗产生不良反应为1～2级[27]，证实新抗原疫苗在肺癌中的有效性及安全性。国内还有研究者利用全外显子测序和计算机算法成功从3例非小细胞肺癌患者中筛选到强免疫原性新抗原，且研究者利用已从体外证实具有免疫原性的新抗原ACAD8-T105I、BCAR1-G23V 和 PLCG1-M425L对荷瘤小鼠进行过继性T细胞治疗，结果提示新抗原特异性T细胞可延缓肿瘤生长[28]。

4 新抗原免疫治疗的联合疗法

免疫检查点抑制剂通过激活宿主免疫系统诱导肿瘤排斥反应，在过去的10多年在多种癌症中取得了极大的成功。但是，免疫检查点阻断疗法单一应用在多数患者中获益有限[29]。一项基于NEO-PV-01新抗原疫苗与程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）抑制剂nivolumab联合治疗晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌晚期癌症ⅠB期研究（NCT02897765）的结果表明，三种癌症的ORR分别为59%、39%、27%，mPFS为23.5个月、8.5个月、5.8个月，明显优于抗PD-1抑制剂单药应用临床数据，且具备良好安全性[30-31]。

化疗和靶向抗肿瘤药物仍是临床抗肿瘤治疗的主力军，可以导致免疫原性细胞死亡，启动级联反应，产生肿瘤特异性新抗原，增强树突状细胞细胞吞噬及抗原呈递，提高新抗原疫苗效率[32-35]。如靶向抗血管生成药物可以重塑肿瘤血管，使其正常化，逆转血管内皮生长因子诱导的单核细胞向树突状细胞分化的抑制作用，恢复癌症患者外周血树突状细胞数量并促进其活化，转化免疫抑制微环境，增强新抗原递呈，从而增强抗肿瘤免疫治疗[36]。

免疫治疗和放疗被临床证实为很好的“搭档”。放疗可诱导肿瘤细胞释放更多的抗原，且放疗可增强T细胞向肿瘤组织运输。有研究者利用三阴乳腺癌小鼠模型发现，放疗可增强免疫原性新抗原基因表达，并引发CD8+和CD4+ T细胞反应，导致MHC -Ⅱ和死亡受体上调，此外，新抗原特异性CD8+ T细胞优先杀死辐射的肿瘤细胞，提供新抗原与放疗联合应用可控制肿瘤证据[37]。1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

5 展望

目前，基于腫瘤新抗原的免疫疗法虽然仍在临床试验过程中，但捷报频传，以往“非同义突变”被认为是新抗原主要来源。最新的实验结果表明，融合基因新抗原具有更高的免疫原性，是癌症免疫疗法新兴的靶标，可作为免疫检查点疗效的预后生物学标志物[38]，受到研究者的广泛关注。然而结合本课题组的自身实践，抗肿瘤新抗原疗法仍有许多难题尚未得到有效解决：①常见实体瘤驱动基因突变产生的新抗原，其免疫原性较弱;②HLA等位基因型繁多，HLA限制性新抗原明确缺乏有效的预测手段，主流预测抗原与HLA亲和力的数据库，其预测效率不高，存在假阳性;③新抗原鉴定流程复杂，亟待优化;④新抗原治疗个体性强，其治疗成本较高，且无法普及等。而这些问题的解决一方面需要新兴检测技术的发展，另一方面可能需要如生物信息学技术、结构生物学、药物设计学等学科的交叉与融入，如通过机器学习大量HLA限制性新抗原数据，确立有效的免疫应答位点;结合冷冻电镜观察不同新抗原HLA-TCR三者复合体的晶体结构，明确相互作用的关系;修饰新抗原使其更容易被CTL识别并针对靶细胞产生特异性免疫应答等。上述问题的深入探讨与研究将为新抗原疗法临床实践的顺利开展提供坚实的前期基础，期待新抗原将在今后的肿瘤治疗中发挥不可或缺的重要地位。

[参考文献]

[1]   World Health Organization （WHO）. World cancer report 2020. 2020. URL： https：//www.iarc.fr/cards_page/world-cancer-report/.

[2]   苏萌，黄常新. 结直肠癌免疫治疗的临床研究及进展[J].浙江临床医学，2020，22（11）：1689-1692.

[3]   Laumont CM，Vincent K，Hesnard L，et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens[J].Sci Transl Med，2018，10（470）：eaau5516.

[4]   Prehn RT，Main JM. Immunity to methylcholanthrene-induced sarcomas[J].J Natl Cancer Inst，1957，18（6）：769-778.

[5]   Wang P，Chen Y，Wang C. Beyond tumor mutation burden： Tumor neoantigen burden as a biomarker for immunotherapy and other types of therapy[J].Front Oncol，2021，11：672 677.

[6]   Zhu Y，Hu B，Zhang S，et al. Neoantigen detection in postoperative colorectal cancer patients by next-generation sequencing and liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Med Imaging Health Inform，2020，10（12）：2905-2912.

[7]   Zhu Y，Hu B，Xu L，et al. Tumor-specific nascent nine-peptide-epitopes prediction and bioinformatics characterization in human colorectal cancer[J].J Med Imaging Health Inform，2020，10（6）：1338-1345.

[8]   Mcgranahan N，Swanton C. Neoantigen quality，not quantity[J].Sci Transl Med， 2019，11（506）：eaax7918.

[9]   Richard G，Groot A，Steinberg GD，et al. Multi-step screening of neoantigens′ HLA-and TCR-interfaces improves prediction of survival[J].Sci Rep，2021，11（1）：9983.

[10]  Lu YC，Robbins PF. Cancer immunotherapy targeting neoantigens[J].Semin Immunol，2016，28（1）：22-27.

[11]  Hashimoto S，Noguchi E，Bando H，et al. Neoantigen prediction in human breast cancer using RNA sequencing data[J].Cancer Sci，2021，112（1）：465-475.

[12]  Blass E，Ott PA. Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines[J].Nat Rev Clin Oncol，2021，18（4）：215-229.1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

[13]  Wells DK，Van Buuren MM，Dang KK，et al. Key parameters of tumor epitope immunogenicity revealed through a consortium approach improve neoantigen prediction[J].Cell，2020，183（3）：818-834.e13.

[14]  Huang C，Chen J，Ding F，et al. Related parameters of affinity and stability prediction of HLA-A*2402 restricted antigen peptides based on molecular docking[J].Ann Transl Med，2021，9（8）：673.

[15]  Zhu Y，Huang C，Su M，et al. Characterization of amino acid residues of T-cell receptors interacting with HLA-A*02-restricted antigen peptides[J].Ann Transl Med，2021，9（6）：495.

[16]  Bassani-Sternberg M，Brunlein E，Klar R，et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry[J].Nat Commun，2016，7：13 404.

[17]  Verma A，Halder A，Marathe S，et al. A proteogenomic approach to target neoantigens in solid tumors[J].Expert Rev Proteomics，2020，17（11-12）：797-812.

[18]  Kalaora S，Samuels Y. Cancer exome-based identification of tumor neo-antigens using mass spectrometry[J].Methods Mol Biol，2019，1884：203-214.

[19]  Gloger A， Ritz D， Fugmann T， et al. Mass spectrometric analysis of the HLA class I peptidome of melanoma cell lines as a promising tool for the identification of putative tumor-associated HLA epitopes[J].Cancer Immunol Immunother，2016，65（11）：1377-1393.

[20]  Chen F，Zou Z，Du J，et al. Neoantigen identification strategies enable personalized immunotherapy in refractory solid tumors[J].J Clin Invest，2019，129（5）：2056-2070.

[21]  Fang Y，Mo F，Shou J，et al.A Pan-cancer clinical study of personalized neoantigen vaccine monotherapy in treating patients with various types of advanced solid tumors[J].Clin Cancer Res，2020，26（17）：4511-4520.

[22]  Wang-Gillam A，Li CP，Bodoky G，et al. Nanoliposomal irinotecan with fluorouracil and folinic acid in metastatic pancreatic cancer after previous gemcitabine-based therapy（NAPOLI-1）：A global， randomised， open-label， phase 3 trial[J].Lancet，2016，387（10 018）：545-557.

[23]  Hu Z，Leet DE，Allese RL，et al. A. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma[J].Nat Med，2021，27（3）：515-525.

[24]  Ott PA，Hu Z，Keskin DB，et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J].Nature，2017，547（7662）：217-221.

[25]  Keskin DB，Anandappa AJ，Sun J，et al. Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial[J].Nature，2019，565（7738）：234-239.1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F

[26]  Rosenthal R，Cadieux EL，Salgado R，et al. Neoantigen-directed immune escape in lung cancer evolution[J].Nature，2019，567（7749）：479-485.

[27]  Ding Z，Li Q，Zhang R，et al. Personalized neoantigen pulsed dendritic cell vaccine for advanced lung cancer[J].Signal Transduct Target Ther，2021，6（1）：26.

[28]  Zhang W，Yin Q，Huang H，et al. Personal neoantigens from patients with NSCLC induce efficient antitumor responses[J].Front Oncol，2021，11：628 456.

[29]  Robert C. A decade of immune-checkpoint inhibitors in cancer therapy[J].Nat Commun，2020，11（1）：3801.

[30]  Ott PA，Hu-Lieskovan S，Chmielowski B，et al. A phase Ib trial of personalized neoantigen therapy plus anti-PD-1 in patients with advanced melanoma，non-small cell lung cancer，or bladder cancer[J].Cell，2020，183（2）：347-362.e24.

[31]  Zaidi N. Can personalized neoantigens raise the T cell bar[J].Cell，2020，183（2）：301-302.

[32]  Pich O，Muios F，Lolkema MP，et al. The mutational footprints of cancer therapies[J].Nat Genet，2019，51（12）：1732-1740.

[33]  Frk M，Krawczyk P， Kalinka E， et al. Molecular and clinical premises for the combination therapy consisting of radiochemotherapy and immunotherapy in non-small cell lung cancer patients[J].Cancers，2021，13（6）：1222.

[34]  Luo Q，Zhang L，Luo C，et al. Emerging strategies in cancer therapy combining chemotherapy with immunotherapy[J].Cancer Lett，2019，454：191-203.

[35]  Jin MZ，Wang XP. Immunogenic cell death-based cancer vaccines[J].Front Immunol，2021，12：697 964.

[36]  Ntellas P，Mavroeidis L，Gkoura S，et al. Old player-new tricks：Non angiogenic effects of the VEGF/VEGFR pathway in cancer[J].Cancers，2020，12（11）：3145.

[37]  Lhuillier C，Rudqvist NP，Yamazaki T，et al. Radiotherapy-exposed CD8+ and CD4+ neoantigens enhance tumor control[J].J Clin Invest，2021，131（5）：e138 740.

[38]  Wang Y，Shi T，Song X，et al. Gene fusion neoantigens：Emerging targets for cancer immunotherapy[J].Cancer Lett，2021，506：45-54.

（收稿日期：2021-10-18）1F3890C3-8A7A-49C8-B0DE-876920586D0F