miR20a自噬炎症小体在子宫内膜异位组织中表达及意义

吕冰峰 秦锦龙

1.江苏省张家港市第二人民医院(215600)；2.同济大学附属上海市第四人民医院

子宫内膜异位症(EMs)机制尚未清楚，经血逆流学说为目前EMs发病主流学说，但最新研究表明EMs是一个复杂的慢性疾病，经血逆流很可能只是EMs的诱因，后续复杂的基因、免疫与环境因素间相互作用在EMs进程中发挥重要作用。微小核糖核酸(RNA))能特异性识别并结合到mRNA的3’非翻译区，在参与靶基因表达后进行负调控。miR20a为该家族成员[1]，与细胞免疫联系紧密，对EMs患者的自身免疫炎症性疾病具有调节作用[2]；miRNA可调节一些炎性因子表达以控制炎症，并在某些炎症小体的相关信号通路中发挥调控作用[3]。炎症小体是免疫系统重要部分，具有促进人体形成天然免疫力，对细菌、病毒等有特异性识别作用[4]。研究表明，细胞自噬是对病原微生物引起的炎症反应进行的精准调控，避免过度炎症反应对人体造成的伤害，构建成自噬-炎症小体通路[5]。miRNA能够从转录后水平对基因表达进行负调控，但不会导致基因消除。miR20a可精细调节自噬-炎症小体信号通路，对治疗EMs非常重要[6]。因此，本研究探讨miR20a-自噬-炎症小体通路在EMs发病中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2019年1月-2020年12月就诊于本院妇产科的EMs患者住院病历，选择子宫内膜组织60例为EMs异位组，年龄(30.4±5.1)岁(24～46岁)；年龄相匹配非ENs女性正常子宫内膜组织60例为对照组，年龄(31.5±6.2)岁(24～48岁)。纳入标准：①经病理确诊Ems；②年龄25～48岁；③月经周期正常，处于卵泡期。排除标准：①拒绝参与本项研究；②并发心脏病，高血脂等代谢异常的疾病；③并发严重的感染性和炎症性等疾病；④并发器官功能障碍；⑤盆腔炎性肿瘤，多囊卵巢综合征；⑥妊娠和哺乳期。纳入者均自愿签署协议书，研究获得院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1组织收集与细胞转染腹腔镜检查或手术刮宫治疗取得两组样本120份，-55℃储存。37℃ 5% CO2培养，DMEM含100U/ml青霉素+100mg/ml链霉素+10%胎牛血清。将EMs细胞以104细胞/孔密度接种到6孔板中，细胞融合度达60%时进行细胞转染，转染前24h将正常血清更换为无双抗100ml/L胎牛血清的DMEM培养液。将异位组织处理后分为EMs异位细胞(EMs组，正常培养)，脂多糖(LPS)诱导的EMs异位细胞(诱导组，加入LPS 10μg/ml)，LPS诱导及mi20a转染的EMs异位细胞(转染组，加入LPS 10μg/ml和miR20a-inhibitor慢病毒转染)。24h后行后续实验。

1.2.2内膜组织中miR20a表达实时荧光定量法检测组织中miR20a表达：采用 Trizol RNA 分离试剂(美国生命技术公司)，用TRIzol试剂盒(武汉艾迪抗生物科技有限公司)提取总RNA，以5μl细胞中总RNA为模板，用TaqMan 逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)在安誉AGS8830-8实时荧光定量 PCR 仪(济南千司生物技术有限公司)行逆转录合成 cDNA。实验用引物在武汉金开瑞生物工程有限公司合成，上游和下游引物序列分别为：miR-20a:5'-CTCAGTTCCTACGCTTCGCA-3',5'-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3';U6:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';实时荧光定量PCR，总反应体系30 μl,含有5 μl引物对、5μl cDNA、10μl Power SYBR Green Master Mix试剂(美国应用生物系统公司)，反应条件：95℃11s；55℃、34s；71℃、1min，45个循环。使用U6小核(snRNA)作为对照分析，以及量化循环法进行相对量化和计算。每个样本重复4次。

1.2.3血清炎性指标水平收集研究对象血清标本，酶联免疫吸附法检测血清中白介素-6(IL-6)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)指标，江苏美正生物科技有限公司生产试剂盒，酶标仪 550nm处测定吸光度计算浓度。

1.2.4细胞ASC、Caspase-1、Beclin-1表达水平分别提取异位组织细胞内总蛋白，Western blotting法检测蛋白浓度，行电泳后转至 PVDF 膜，然后取出 PVDF 膜，完成后再次加入4.5%脱脂牛奶封闭后，添加ASC、Caspase-1、Beclin-1和相应一抗(1：1000) 5 ℃过夜，再用 HRP 标记的山羊抗兔 IgG(1：5000)室温孵2h，清洗 PVDF 膜后加入显色液，曝光显影，软件计算灰度值为蛋白表达量。

1.3 观察指标

不同组织中miR20a，血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β炎症因子表达差异，EMs异位组中EMs组、诱导组、转染组组织细胞中ASC、Caspase-1、Beclin-1蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 内膜组织中miR20a表达

PCR 法检测显示，EMs异位组miR20a的表达水平(2.46±0.32)高于对照组(1.08±0.22)(t=14.345，P=0.003)。

2.2 血清炎症因子水平

血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β水平EMs异位组均高于对照组，且在EMs组、诱导组、转染组中依次升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清中炎症因子水平比较

2.3 异位组织细胞中炎症小体和自噬蛋白的相对表达水平

Western blotting法检测结果显示，EMs组、诱导组、转染组细胞中ASC、Caspase-1、LC3、Beclin-1蛋白相对表达量均依次增加(P<0.05)。表2。

表2 各组组织细胞炎症小体和自噬蛋白相对表达水平比较(灰度值，

3 讨论

多项研究显示[7]，miRNA可与靶基因mRNA进行碱基配对来阻碍翻译过程，具有一定的时序性和功能特异性，在很多炎症疾病、肿瘤疾病中发挥着至关重要作用[8]。miRNA是一个可以调控基因表达作用的重要因子。miR20a是miRNA家族成员，可抑制或降解相应靶细胞参与细胞的增殖和分化，还可以调控炎症因子等生理过程。胡鸿泽等[9]研究表明，miRNA可能参与了子宫内膜症的发生进展过程。多项研究表明[10]，miRNA对炎症小体起着负调控作用，其转录后活性丧失导致无法执行其翻译功能，从而导致大量炎症小体产生。EMs患者炎症小体异常增多，导致病情更加严重[11]。炎症小体可导致炎性因子白介素1-β的释放，使人体天然免疫系统的一个关键组成部分。在分子生物学水平层面上，炎症小体不仅可参与人体免疫调节，而且参与细胞自噬过程[12]。范为民[13]研究表明，自噬和炎症小体在功能上联系非常密切，与机体内的新陈代谢和稳定性维持直接联系，严格调节炎症因子和病原体的清除。自噬常常会识别并吞灭炎症小体的各个组成部分，从而抑制其激活。miR20a、炎症小体、自噬3者间相互具有调控作用，miR20a对EMs治疗起着重要作用。miR20a-自噬-炎症小体通路广泛参与各种生理和病理过程，是目前生物医学领域研究热点。

本研究发现，EMs异位组织中miR20a表达水平高于正常内膜组织，表明miR20a表达在EMs异位细胞中异常增高，可能是导致EMs病情的原因之一。分析认为：miR20a异常表达激活炎症小体通路蛋白，使机体内环境失调继而病情恶化。炎性指标IL-6可促进子宫内膜细胞发育成熟、异常增长，导致EMs患者产生炎症，子宫内膜相应遭到损伤；TNF-α在组织中过量表达会损害子宫内膜，促进子宫内膜炎症发展；IL-1β可以促进子宫内膜细胞增殖分化，与核因子受体激活剂起着协同作用，诱导更多的核基因表达导致病情加重。本文EMs异位组血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β水平均高于对照组，提示EMs异位者炎症因子水平异常升高可能参与了EMs的发生；对EMs异位组不同诱导情况发现，EMs组、诱导组、转染组IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β依次升高，表明miR20a参与了EMs病情发展，可促进炎症因子增加，在炎症反应中发挥作用。EMs组、诱导组、转染组异位组织细胞中ASC、Caspase-1、LC3、Beclin-1蛋白相对表达量依次增加，表明过表达miR20a促进了自噬蛋白和炎症小体的表达量增加，提示miR20a可能是通过调控细胞自噬-炎症小体通路体现其抗炎作用。

综上所述，miR20a的表达可促进自噬-炎症小体信号通路的激活，促进EMs患者炎症因子增加，减轻子宫内膜细胞损伤，增强EMs细胞活性，从而发挥对子宫内膜细胞的修护作用。提示miR20a可作为EMs诊断及预后的生物学标志物，miR20a-自噬-炎症小体通路也为治疗EMs提供新思路。