孕晚期女性生殖道B族链球菌筛查和耐药基因分析

高承香 刘春花 邱建娟

青岛市胶州中心医院(266300)

B族溶血性链球菌(GBS)是革兰阳性球菌，寄居于阴道和直肠[1]。当人体阴道微环境发生变化可导致阴道菌群失衡，发生GBS感染[2]。研究表明，GBS感染的孕妇易发生胎膜早破、泌尿系感染和绒毛膜羊膜炎，导致新生儿感染和黄疸[3]。因此，GBS感染会影响分娩结局，产前应对孕妇GBS进行筛查。《预防新生儿早发型B组链球菌病：ACOG委员会共识》推荐孕妇常规在孕36周行GBS筛查，并对阳性者给予抗生素预防，以减灭母体GBS感染，减少新生儿GBS感染，降低早发型GBS疾病的发病率和败血症风险[4-5]。因我国较少开展孕产妇GBS筛查项目，潜在GBS感染若未能及时发现，可增加不良妊娠结局。因此本研究分析孕晚期女性生殖道GBS筛查、药敏特征和相关耐药基因，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年12月-2020年09月本院妇产科收治的孕晚期女性245例作为研究对象。纳入标准：①正常妊娠且在本院产前检查；②年龄20～40岁，孕周36～37周；③知情同意。排除标准：①心脑肾等脏器功能受损者；②精神疾病；③2周内使用抗生素；④两周内有过性生活。经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1仪器与试剂GBS培养基为哥伦比亚血琼脂基础培养基、上海玛嘉微生物技术有限公司的ToddHewrtt培养肉汤和绵阳血清培养基，GBS鉴定采用VITEK2全自动分析仪(法国生物梅里埃公司)，药敏定量试验采用VITEK2全自动仪(法国生物梅里埃)，质控菌株为肺炎链球菌(ACTT49615)，DNA提取试剂盒(北京生物工程)。

1.2.2标本采集及培养每组患者采集两根试子，常规消毒后1根涂抹阴道下1/3处，30min内送检。另1根涂沫肛门括约肌上2～3cm处，放入试管GBS增菌肉汤中，温度<35℃，培养后接种于血琼脂培养基上，温度<35℃，培养24～48h，将细菌在血琼脂培养基上纯培养，革兰氏染色，显微镜下鉴定菌落种类。药敏试验：待测菌落稀释至0.5 McIntosh单位，接种于血清培养基，待菌液干燥后，粘贴抗菌药物纸，间隔12mm，在35℃、5%CO2培养24～48 h，参照MI00-S22[6]判断药敏结果。用纸片扩散法对敏感菌株和中间菌株进行D-抑制区实验。耐药基因检测：采用PCR法检测试验阳性的B组链球菌耐药基因，反应体系体积为25μl，ddH2O 17μl 10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，Taq DNA Polymerase 0.25μl，镁离子1.5μl，上下游引物各1μl，模板DNA 1.25μl；5 min95℃预变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1min 30s，共35次循环，最后一个循环后在72℃保存10 min，4℃保存。

2 结果

2.1 GBS感染情况

245例年龄(31.6±5.2)岁(20～40岁)，孕周(36.6±2.0)周(36～37周)。阴道或直肠分泌物标本中检出阳性标本25例，阳性率为10.2%。

2.2 25株GBS菌株的药物敏感性

25株GBS菌株对头孢噻肟、万古霉素、庆大霉素、利奈唑胺、青霉素、氨苄西林、头孢曲松、呋喃妥因敏感性均高，均>85%；对克林霉素、红霉素、四环素耐药率较高，均>30%。见表1。

表1 25株GBS菌株的药物敏感性结果[株(%)]

2.3 克林霉素、红霉素、四环素耐药表型与基因型相关性

25株GBS菌株中对克林霉素、红霉素、四环素耐药的菌株共有17株，依据抗生素药物敏感性试验和D试验结果，GBS对大环内酯类抗生素的耐药表型以cMLSB表型为主(64.7%)，其次为M表型(17.7%)、iMLSB表型(11.7%)、L表型(5.9%)；17株(100.0%)耐红霉素的GBS菌株全部检出ermB基因；7株(14.2%)检出mefE基因；14株(82.4%)检出mefA基因；2株(11.8%)检出ermTR基因；5株(29.4%)检出linB基因；未检出ermA、ermC、ermM基因。见表2。

表2 克林霉素、红霉素、四环素耐药表型与基因型相关性

3 讨论

GBS是临床常见致病菌。妊娠妇女GBS带菌率为10%～30%，且可导致1%～2%新生儿产生早发型GBS感染，从而导致新生儿肺炎、脑膜炎，增加患儿死亡率，且死亡率高达20%～50%[7]。而感染GBS的孕妇易发生胎膜早破，而胎膜早破易导致羊膜腔感染[8]。除此之外，感染GBS的孕妇可发生早产、胎儿发育不良，还可引起新生儿肺炎、败血症及脑膜炎等，甚至导致新生儿死亡。不仅危害新生儿健康，同时对家庭也产生了一定的经济负担[9]。因此本研究对围产期孕妇行GBS普筛，进行GBS培养，对GBS定值人群尽早干预，以降低胎膜早破、绒毛膜羊膜炎及新生儿早发型GBS感染的发病率，改善母婴结局[10]。

本研究结果显示，245例孕晚期女性阴道或直肠分泌物中检出阳性率为10.2%。与国内[11-12]报道相符，说明临床应重视GBS筛查。同时研究发现，25株GBS菌株对头孢噻肟、万古霉素、庆大霉素、利奈唑胺、青霉素、氨苄西林、头孢曲松、呋喃妥因敏感性均高，与汪洁等[13]报道一致，说明GBS对青霉素和头孢类药物敏感性较好，其中青霉素是治疗GBS首选药物，为窄普抗菌药物，但越来越多临床研究表明，青霉素存在一定耐药率。同时由于万古霉素具有一定的肝肾毒性，因此可选用青霉素。而本研究显示，青霉素耐药率为4.0%，考虑其敏感性降低可能与青霉素结合蛋白的突变有关[14]；对克林霉素、红霉素、四环素耐药率较高，考虑与不规范用药有关，不建议临床采用克林霉素、红霉素、四环治疗。而左氧氟沙星耐药率为22.5%，但对胎儿关节软骨有一定损害，因此临床应慎用[15]。

目前，GBS对大环内酯类的耐药主要有erm基因编码的核糖体甲基化酶和mef基因编码的外排泵蛋白引起。本研究进一步分析克林霉素、红霉素、四环素耐药表型与基因型相关性，结果发现，25株GBS菌株中对红霉素耐药或克林霉素耐药的菌株有17株，且GBS对大环内酯类抗生素耐药以cMLSB表型为主，其次为M表型、iMLSB表型、L表型，其中红霉素耐药菌株的耐药基因主要为ermB。相关研究发现，ermB基因单个核苷酸SNP突变会导致23SrRNA甲基化酶功能改变，进而降低抗菌药物浓度[16]。且研究发现，红霉素耐药基因多以基因组合形式出现，其大多数同时携带2种及以上耐药基因，可能与国内GBS对红霉素高度耐药有关，未检出ermA、ermC、ermM基因，与国外报道研究不符[17]，可能与人种差异有关。进一步提示红霉素耐药GBS菌株中同时存在多个耐药基因，临床应当重视并合理使用抗生素。

综上所述，临床应对孕晚期妇女行GBS检测，并监测耐药性变化实施针对性干预，以保证产妇及围生儿健康，避免抗生素滥用导致病原微生物耐药问题。