CYP2D6基因在结直肠癌细胞侵袭和迁移中的作用及调控机制研究

黄明 江明凤 邱黎清

结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是常见消化道恶性肿瘤之一，全球癌症流行病学数据库（GLOBOCAN）2018数据显示，每年全球CRC新发病例数近1 800 000，死亡病例数超过800 000，居恶性肿瘤第3位[1-2]。越来越多的研究显示，多种遗传及表观遗传上的异常和积累与CRC的发生、发展密切相关[2-3]。目前通常采用以手术切除、放疗和化疗为主的综合治疗，但预后较差，很多患者术后发生转移，而对于这些患者尚缺乏有效的治疗手段[4]。淋巴结转移导致的并发症仍是CRC患者死亡的主要原因，N2淋巴结转移患者的5年总生存率仅为10.9%[5]。因此，CRC转移过程的分子机制亟待深入探索且意义重大。

其中DNA甲基化修饰、组蛋白翻译后修饰是CRC表观遗传的主要调控机制并日益受到关注[6-9]。细胞色素P450酶系（cytochrome P450,CYP）是人体中最重要的Ⅰ相药物代谢酶[10]。CYP等位基因的多态性与CRC的发生、侵袭、迁移密切相关[11-12]。作为CYP家族成员之一，CYP2D6基因主要表达于肝脏及一些肝外器官（如脑和肠），尽管其含量仅占肝脏CYP总量的1.3%～4.3%，但其介导了肝脏中近20%处方药的代谢（超过160种）[13-14]。然而，CYP2D6基因是否参与肿瘤细胞转移的报道较少。因此，本研究旨在探讨CYP2D6基因在CRC细胞侵袭和迁移中的作用，并对其调控机制进行初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料 本实验所用CRC组织及其配对的正常组织来源于2018年6月至2019年7月杭州市肿瘤医院接受手术的CRC患者。CRC组织取自原发癌灶，配对的正常组织取自距癌灶边缘5 cm以上的正常结直肠组织，最终收集28对组织标本并立即保存于RNAlaterTMSOLUTION中用于mRNA分析。纳入标准：（1）患者年龄≥18周岁，男女不限；（2）经组织病理学检查明确诊断为CRC；（3）患者为新发病例，尚未接受手术、化疗或靶向治疗等治疗；（4）能够获得足够的新鲜肿瘤组织标本。排除标准：（1）患者缺乏病理诊断；（2）非CRC新发患者；（3）无法通过手术获得足够的新鲜肿瘤组织标本；（4）无法获得随访信息的患者；（5）研究者认为其他不适合入组的患者。本研究经本院医学伦理委员会批准[批件号：（HZCH-2018）快审第（009）号]，所有患者均签署知情同意书。

CRC细胞系HT29和SW480购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 主要试剂与仪器 RNAlaterTMSOLUTION（AM7020）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；RNAsimple总RNA提取试剂盒（DP419）购自中国天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录试剂盒（DRR036A）和 Real Time SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒（DRR420A）购自日本宝日医生物技术（北京）有限公司；总RNA提取试剂盒（AP-MN-MSRNA-250G）购自美国爱思进生物技术有限公司；OPTI-MEMI（1×）（31985-062） 购自美国 Gibco公司；Matrigel matrix基质胶（356234）购自美国BD公司；DMSO（D5879）、DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-2'-deoxycytidine（DAC）（A3656）、anti-CYP2D6（QC12317）一抗购自美国Sigma-Aldrich公司；组蛋白去乙酰化酶抑制剂 Vorinostat（SAHA）（S1047）购自美国 Selleck Chemicals公司；Lipofectamine3000Reagen（tL3000-015）购自美国 Invitrogen公司；anti-GAPDH（AM1020b）一抗购自苏州百远生物科技有限公司；FDbio-Femto ECL Ki（tFD8030）购自杭州弗德生物科技有限公司；RIPA裂解液（P0013B）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012）、苯甲基磺酰氟（PMSF）（ST505）、蛋白酶抑制剂 Leupeptin（SG2012）、蛋白酶抑制剂 Pepstatin A（SG2016）均购自上海碧云天生物技术有限公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）彩色浓缩胶试剂盒（BP108）、10%SDS-PAGE预混分离胶试剂盒（BP114）均购自上海铂莱生物科技有限公司；Goat anti-Rabbit二抗（7074P2）和Goat anti-Mouse二抗（7076P2）均购自美国Cell Signaling公司。引物、pcDNA3.1-CYP2D6质粒和pcDNA3.1空载质粒均由上海生工生物工程有限公司合成。

IX51型电子显微镜购自日本Olympus公司；CO2培养箱、1300系列Ⅱ级A2型生物安全柜、高速冷冻离心机FRESCO 17均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；细胞计数仪Countstar IC1000购自深圳亨睿生物科技有限公司；荧光定量PCR仪ABI 7500及配套分析软件均购自美国ABI公司；Mini-Proten Tetra System电泳系统购自美国Bio-RAD公司；凝胶成像系统GenoSens1500购自上海勤翔科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息学分析 利用公开的数据库OncomineTM对已公开的Microarray数据进行分析，比较CRC组织和正常组织中CYP2D6基因 mRNA表达水平的变化。阈值设定：P≤0.05，Fold Change：2；Gene Rank：all；DATA TYPE：mRNA。

1.3.2 细胞培养、分组及处理 将HT29和SW480细胞培养于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，培养基分别为McCoy's 5A和Leibovitz's L-15，各添加10%FBS和1×青霉素链霉素。选择对数生长期的HT29和SW480细胞，HT29细胞接种量为每孔3×106个细胞，SW480细胞接种量为每孔2.5×106个细胞，分别接种于6孔板中。培养24 h后，每种培养的细胞分为4组，第一组为DMSO组，细胞培养液中加入0.1%DMSO，继续培养72 h；第二组为甲基化抑制组（DAC组），细胞培养液中加入终浓度为5 μmol/L的DAC，继续培养72 h；第三组为乙酰化抑制组（SAHA组），细胞培养液中先加入0.1%DMSO，培养24 h后，细胞培养液中加入终浓度为1 μmol/L的SAHA继续培养48 h；第四组为甲基化和乙酰化双抑制组（DAC+SAHA组），细胞培养液中先加入终浓度为5 μmol/L的DAC培养24 h，再加入终浓度为1 μmol/L的SAHA，继续培养48 h。

1.3.3 组织及细胞总RNA提取 取28对CRC组织及其配对的正常组织各约20～50 mg，剪碎，用液氮充分研磨后，加入1 ml的裂解液，随后转移至1.5 ml EP管中，组织RNA提取按照RNAsimple总RNA提取试剂盒的操作说明书操作。分别收集各组细胞，按照总RNA提取试剂盒的操作说明书提取细胞RNA。测定组织样本及细胞样本RNA浓度，用PrimeScriptTMRT Master Mix进行逆转录得到相应的cDNA，进行荧光定量PCR。

1.3.4 CRC组织和各组细胞CYP2D6基因mRNA表达水平的检测 采用荧光定量PCR法。将组织样本及细胞样本的cDNA，用Real Time SYBR Premix Ex TaqTM荧光定量试剂盒检测对应基因的mRNA表达水平。定量引物序列如下，CYP2D6-F：3'-TTCCTCAGGCTGCTGGAC-5'；CYP2D6-R：3'-CGCTGGGATATGCAGGAG-5'；内参 PPIB-F：3'-TGTGGTGTTTGGCAAAGTTC-5'；PPIB-R：3'-GTTTATCCCGGCTGTCTGTC-5'。10 μl体系中包含以下组分：Real Time SYBR Premix Ex TaqTM（2×）5 μl，引物（2 μmol/L）各 0.5 μl，模板1 μl，ddH2O 3 μl。PCR 参数为：预变性 95 ℃ 30 s；变性95℃ 5 s，退火、延伸60℃ 30 s共40循环；熔解曲线 95℃ 15 s，60℃ 1 min，Ramp increment 0.3℃，95℃ 15 s。检测CRC组织和各组细胞CYP2D6基因mRNA表达水平。

1.3.5 各组细胞CYP2D6蛋白表达水平的检测 采用Western blot法。用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）消化处理过的细胞，加入等体积完全培养液，1 000 r/min，室温离心5 min，弃上清液；加入1 ml冰PBS清洗，1 000 r/min，4℃离心5 min，弃上清液。将细胞置于6 cm的细胞皿中并加入60 μl预冷过的RIPA裂解液[临用前加入 Leupeptin（终浓度 0.5 μg/ml）、PMSF（终浓度 1 mmol/ml）和 Pepstatin A（终浓度 0.7 μg/ml）]，混匀后置于冰上裂解30 min，每隔10 min充分震荡1次。13 000 r/min，4℃离心30 min，取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，具体操作参见试剂盒操作说明书。测定浓度后，加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）将浓度调整为 3 μg/μl，沸水变性10 min，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，去除封闭液，加入anti-CYP2D6一抗及anti-GAPDH一抗，4℃孵育过夜。次日回收一抗，1×TBST洗涤10 min×3次。然后分别加入 Goat anti-Rabbit二抗和Goat anti-Mouse二抗，室温孵育2 h，继续用1×TBST洗涤10 min×3次。等体积混匀FDbio-Femto ECL Kit试剂盒中的A液和B液，滴加到PVDF膜上孵育2 min，将PVDF膜放凝胶成像系统里进行曝光，检测DAC和SAHA分别及联合处理后HT29和SW480细胞的CYP2D6蛋白表达水平。

1.3.6 转染实验 将对数生长期的HT29细胞以50%的密度接种于6孔板中，根据Lipofectamine3000转染试剂说明书进行转染实验。取洁净EP管，每 120 μl OPTI-MEMⅠ加入 3 μl Lipofectamine3000转染试剂，混匀，室温静置5 min。另取洁净EP管，每 125 μl OPTI-MEMⅠ加入转染终浓度为1 μg的pcDNA3.1-CYP2D6质粒和pcDNA3.1空载质粒，混匀，分别和转染试剂溶液混匀，室温孵育15 min。将孵育结束后的混合溶液每孔250 μl加入细胞中，轻轻摇晃均匀，将转染pcDNA3.1-CYP2D6基因质粒的HT29细胞作为实验组，转染pcDNA3.1空载体的HT29细胞作为对照组。将两组细胞置于细胞培养箱中培养6 h后替换为新的完全培养基，继续培养48 h后进行后续实验。

1.3.7 Transwell细胞侵袭实验 收集实验组和对照组细胞，将细胞重悬稀释至 1×105个/ml，吸取 100 μl的细胞悬液加入Transwell上室中（事先铺好终浓度为 250 μg/ml的 Matrigel matrix胶），下室加入 600 μl完全培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。隔天Transwell上室换成100 μl无血清培养液，下室加入600 μl完全培养液，培养板放入37℃、5% CO2培养箱中培养36 h。取出Transwell上室，弃尽培养液，用棉棒擦去Matrigel matrix胶和聚酯膜上表面的细胞，取出上室，用多聚甲醛固定，室温放置15 min；结晶紫溶液染色，室温放置15 min；显微镜下拍照记录上室细胞数量变化。

1.3.8 细胞划痕试验 在6孔板中接种实验组和对照组细胞，细胞数为6×106个；待细胞铺满板底后，用200 μl的枪头垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致；吸弃细胞培养液，用PBS洗孔板2次，洗去划痕产生的细胞碎片；加入无血清培养基，拍照记录；将6孔板放入37℃、5% CO2培养箱中培养。按0、12 h拍照记录；根据收集图片，分析并统计细胞迁移能力。

1.4 统计学处理 采用Prism 6统计软件。计量资料以表示，28对CRC组织标本结果分析采用配对Wilcoxon符号秩和检验，细胞实验数据分析采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP2D6基因在CRC组织的表达水平 Oncomine数据库中Microarray数据显示见图1，CRC组织CYP2D6基因的表达水平显著低于正常组织（P＜0.05）。为确认数据库所得的结论，本研究将28对CRC组织及其配对的正常组织进行荧光定量PCR检测。结果显示，CRC组织CYP2D6基因mRNA表达水平明显低于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1 Oncomine数据库中CRC组织与非配对的正常组织中CYP2D6基因的表达水平

图2 CRC组织及其配对的正常组织中CYP2D6基因的表达情况（a：CRC组织及其配对的正常组织中CYP2D6基因mRNA的表达水平；b：CYP2D6基因在28对患者CRC组织及其配对的正常组织中表达水平比较）

2.2 表观遗传药物对CRC细胞CYP2D6基因及蛋白表达水平变化的比较 结果显示，经DAC处理后，与DMSO组比较，HT29和 SW480细胞 CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表达水平均明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。经SAHA处理后，与DMSO组比较，HT29和SW480细胞CYP2D6基因mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），CYP2D6蛋白表达水平明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。DAC+SAHA组与DMSO组、DAC组和SAHA组相比，HT29和SW480细胞CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表达水平均明显上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图3。

图3 表观遗传药物DAC、SAHA处理CRC细胞CYP2D6基因mRNA和CYP2D6蛋白表达水平的比较（a：药物处理各组后HT29和SW480细胞CYP2D6基因mRNA表达水平b：药物处理各组后HT29和SW480细胞CYP2D6蛋白表达电泳图；c：药物处理各组后HT29细胞CYP2D6蛋白灰度分析图；d：药物处理各组后SW480细胞CYP2D6蛋白灰度分析图）

2.3 CYP2D6基因过表达细胞侵袭和迁移能力变化的比较 划痕实验结果显示，CYP2D6基因过表达后，HT29细胞的迁移能力明显弱于对照组（图4a，插页）；Transwell细胞侵袭实验结果发现，HT29细胞过表达CYP2D6基因后下室侧膜上细胞数量明显低于对照组（图4b，插页）。

图4 CYP2D6基因过表达细胞侵袭和迁移能力变化的比较（a：划痕实验；b：Transwell细胞侵袭实验）

3 讨论

CRC是临床最常见的恶性肿瘤之一，其发病率排名第3位，但死亡率排名第2位[15]。由于缺乏有效的治疗手段，晚期CRC患者的死亡率很高，转移是CRC患者复发和死亡的主要原因[15-16]。CRC的转移进程受遗传学和表观遗传学的有序及综合调控[17-18]。CRC转移的发生及调控机制一直是CRC研究的热点和焦点。

CYP2D6是CYP家族中重要的药物代谢酶，已有越来越多的研究显示，其基因的多态性与多种癌症的发生密切相关，如肺癌[19]、乳腺癌[20]、膀胱癌[21]、前列腺癌[22]等。本研究初步明确了CYP2D6基因与CRC的转移密切相关：第一，CRC组织中的CYP2D6基因表达水平明显低于正常组织；第二，CYP2D6基因的过表达可抑制CRC细胞的侵袭和迁移。

DNA甲基化是研究最深入的表观遗传调控机制之一。已有研究表明，作为DNA甲基化转移酶抑制剂，DAC可逆转DNA的甲基化过程[23]。本研究结果显示，DAC处理后HT29和SW480细胞CYP2D6基因表达水平明显增加，暗示CRC患者CYP2D6基因表达水平的降低可能与甲基化有关。

组蛋白的乙酰化修饰是组蛋白翻译后修饰的主要形式之一，而在肿瘤中，组蛋白的乙酰化修饰往往存在异常和紊乱。SAHA作为去乙酰化酶抑制剂，可有效抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，进而调控组蛋白的乙酰化修饰[24]。本研究结果显示，经SAHA处理后，HT29和SW480细胞内CYP2D6基因的表达水平和CRC细胞的转移能力并无明显变化，但与SAHA联合处理后，CYP2D6的表达水平比DAC单独处理有明显升高。上述结果表明CYP2D6基因的表达主要受DNA甲基化的调控，组蛋白乙酰化修饰具有一定的协同效应，其具体的作用机理仍有待进一步深入研究。

上述两个表观遗传药物处理CRC细胞后，CRC细胞CYP2D6基因低表达情况逆转，划痕实验和Transwell细胞侵袭实验结果显示，HT29细胞过表达CYP2D6基因后可显著降低细胞的侵袭能力和迁移能力。

综上所述，本研究首次提出并初步确认了CYP2D6基因在CRC细胞中具有抑制细胞转移作用，并初步明确了细胞内CYP2D6基因的表达受表观遗传修饰的调控。