不同蒸制时间对三七总黄酮和多糖含量的影响

马敏敏 朱婉萍 万晓青

1 浙江中医药大学 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310007

3 浙江医院 浙江 杭州 310013

三七属于五加科植物，有生、熟之分，作用有“生消熟补”之别。生三七功专止血祛瘀、消肿止痛，而熟三七则以补血、补气作用较强。前期研究表明，蒸制是三七最常用的炮制方法，目的是使其药材软化，以增强三七的补益作用，缓和其药性。研究发现[1]，熟三七中的总皂苷含量高于生三七；并且随着蒸制时间的变化，三七总皂苷含量呈现出先升高而后逐渐降低的趋势。本研究通过对三七不同蒸制时间的观察，明确蒸制时间对三七总黄酮和多糖含量的影响，根据其含量差异的比较，确立三七的理想蒸制时间，为三七的炮制方法和相关质量标准提供参考，为临床更好地选择三七炮制品提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备：PerkinElmer Lambda45紫外分光光度计（美国珀金埃尔默公司）；DG120型粉碎机（浙江省瑞安市春海药材器械厂）；DGG-9240A型立式电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；MILLI-Q SynthesisA 10纯水仪（美国Millipore公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；恒温水浴锅 XMTE-2000型号R201D；FA 2204B电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂：生三七（产地云南），购自于杭州华东医药股份有限公司药材参茸分公司；标准对照品：葡萄糖和芦丁均购自于中国食品药品检定研究院。硝酸铝、乙醇、亚硝酸钠、硝酸钠、氢氧化钠、浓硫酸均是分析纯，5%苯酚试剂由实验室配置，水是自制超纯水（由纯水仪制备）。

2 方法与结果

2.1 三七的炮制：取300g生三七饮片，平均分成三等份，放置于100℃的蒸笼中，分别蒸制1、1.5、2h，再从笼中取出，经晾干，打粉，再过3号筛即可[1]。

2.2 不同蒸制时间三七总黄酮含量测定：分述如下。

2.2.1 供试品溶液的制备：分别精确称取三七粉末各100mg，经上述“2.1”项处理，置于50ml锥形瓶中，精密加入25ml的70%乙醇，经过50min超声处理，补足失重，取出，离心15min（3500r/min）后，再取上清液，通过在恒温水浴锅内浓缩至10ml容量瓶中，摇匀即得。

2.2.2 对照品溶液的制备：精密称取芦丁10.38mg，干燥至恒重，再置于25ml容量瓶中，后加70%乙醇适量，加热于80℃水浴中，使其溶解并冷却，用70%乙醇稀释至刻度摇匀，即得芦丁对照品溶液（0.415mg/ml）。

2.2.3 测定波长的确定：取5ml的芦丁对照品溶液（0.415mg/ml)，再置于25ml容量瓶中，加1ml的5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6min，再加入1ml的10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min后，再加入10ml氢氧化钠溶液（1mol/L），用70%乙醇稀释至刻度，静置10min，确定检测波长最大吸收波长为507.07nm，见图1。

图1 芦丁标准溶液的最大吸收波长扫描

2.2.4 线性关系考察：精密移取0、0.5、1、2、3、4ml的对照品溶液，分别置于25ml容量瓶中，再加1ml的5%亚硝酸钠溶液，且摇匀静置6min，再加入1ml的10%硝酸铝溶液，摇匀后静置6min，再加10ml氢氧化钠溶液（1mol/L)，用70%乙醇稀释至刻度静置10min，以0ml作为空白对照，在507.07nm波长处，采用分光光度法来测定吸收度，吸光度（A）作为横坐标，浓度（C）作为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=0.4909x+0.0003（R2=0.9999)，说明线性关系为良好。

2.2.5 精密度试验：同“2.2.4”项下方法操作，取5ml供试品溶液，重复6次测吸光度，RSD为0.210%，说明仪器精密度符合要求。

2.2.6 稳定性试验：同“2.2.4”项下方法操作，取5ml供试品溶液，分别测定其在10、20、30、40、50、60min时吸光度，RSD值为1.001%。说明显色在60min内稳定，符合要求。

2.2.7 重复性试验：取6份样品，在同一蒸制时间下，再按供试品溶液制备的方法制备，同“2.2.4”项方法来测定其吸光度，RSD为3.521%，符合重复性试验要求。

2.2.8 样品含量测定：精密称取三七样品各1000mg，在不同蒸制时间下，同“2.2.1”项制备供试品溶液，检测其总黄酮含量的变化。表1提示蒸制1.5h总黄酮含量最高。

表1 在不同蒸制时间下三七总黄酮含量变化

2.3 不同蒸制时间三七多糖含量测定：分述如下。

2.3.1 供试品溶液的制备：分别精确称取三七粉末各500mg，经上述“2.1”项处理，再加水80ml，通过2h的加热回流，经静置冷却后定容至100ml容量瓶内摇匀，通过离心后，再取上清液，精密移取上清液1ml与30ml无水乙醇，摇匀后冰箱冷冻，1h后取出，离心15min（3500r/min），丢弃清液，用热水溶解沉淀，静置定容至5ml容量瓶中，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备：精密称取9.1mg的葡萄糖，再加适量水，溶解后转移至100ml容量瓶中，加水至刻度线，摇匀后即得对照品，标准葡萄糖溶液浓度为91μg/ml。

2.3.3 测定波长的确定：取各0.4ml的葡萄糖对照品溶液和供试品溶液，分别静置于25ml比色管中，再加0.6ml的水、1ml的苯酚溶液和5ml的浓硫酸，并摇匀，经冷却后检测，如图2A和图2B所示，确定检测波长最大吸收波长为488nm。

图2A 供试品溶液显色后光谱

图2B 对照品溶液显色后光谱

2.3.4 线性关系考察：精准吸取标准溶液于试管中，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7ml，再加水补足至1ml，同“2.3.3”项方法进行操作，在488nm处测定其吸收值，吸光度（A）作为纵坐标，标准溶液浓度（C）作为横坐，绘制标准曲线，得线性回归方程为y=0.0649x+0.0097（R2=0.9995），表明葡萄糖标准品线性关系良好。

2.3.5 精密度试验：取0.4ml的同一供试品溶液，同“2.3.4”项方法进行操作，通过连续6次测定溶液的吸光度，得RSD=0.15%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验：取同一供试品溶液，分别测定其在10、20、30、40、50、60min 时吸光度，计算得其 RSD=0.16%，表明样品在1h内稳定。

2.3.7 重复性试验：取6份同一时间下的样品，按照供试品溶液制备的方法制备，同“2.3.4”项方法操作，得总多糖的平均质量分数为142.61mg/g，RSD=1.83%，结果表明本方法重复性良好。

2.3.8 样品含量测定：精密称取三七粉样品各500mg，在不同蒸制时间下，同“2.3.1”项制备供试品溶液，检测其多糖含量的变化。表2提示蒸制2h多糖含量最高。

表2 在不同蒸制时间下三七多糖量变化

3 讨论

中草药三七是目前临床较为常用的活血化瘀止血药。目前对三七皂苷的研究较多，对三七总黄酮和多糖的研究较少。研究发现，生三七经过蒸制后，多糖的含量增加，可能是因为皂苷水解脱糖所导致，而这又是补血作用的主要物质，因此猜测熟三七的补血作用和多糖类成分有密切关系[2]。三七中的黄酮成分含有药理活性种类较多，在抗氧化方面具有较强的清除自由基能力[3]。本研究发现蒸制后的三七中总黄酮和多糖含量是明显高于生三七的；总黄酮含量随着蒸制时间的变化成先升后降的趋势，在1.5h时含量最高，在2h时含量略有下降；多糖含量随着蒸制时间变化逐渐升高，在2h时含量最高。