不同年龄成年伊犁马粪便真菌群落结构的分析

陈雪静,吾尔恩·阿合别尔迪,木古丽·木哈西,玛依拉·吐尔地别克

(伊犁师范大学 生物与地理科学学院,新疆 伊宁 835000)

新疆维吾尔自治区是我国马品种数量最多的省份。马产业是新疆地方特色且重要的现代畜牧业，它对改善新疆农村经济状况、增加牧民收入、促进社会和谐具有极为重要的意义。新疆的马肉产量对我国乃至世界马肉产量均具有重大贡献。截止到2017年末我国马匹存栏为343.7万只，其中新疆占比为20.0%，全国排名第二，仅次于四川省，是我国主要马匹养殖区之一。伊犁州直属县(市)、阿勒泰和塔城地区拥有全疆大部分马产业，马匹存栏量分别占全疆总量的45.1%、14.8%和12.1%，马肉产量分别达到33 811 t、4 520 t和10 242 t，占全疆马肉总产量的73%。这三个地区主要品种为伊犁马和哈萨克马。

近年来肠道菌群成为学术界热点研究领域之一。人体是由数以万亿计的细胞组成，而胃肠道中聚集的微生物的数量也达到了同样的数量级，在其他动物肠道内微生物数量和种类也非常丰富，因此肠道菌群的微生态平衡就像一种器官，对机体各种生理功能具有非常重要的作用。动物胃肠道菌群可以直接影响机体的能量代谢、消化功能、黏膜免疫系统的发育、疾病的发生和发展，对于马等草食动物而言更是如此，其生活主要依赖于胃肠道内的微生物对纤维素等结构性碳水化合物的发酵作用。

国内外对马肠道微生物，尤其对肠道真菌群落结构和多样性的研究较罕见。邢振存采用PCR-DGGE技术从蒙古马和纯种马粪便分别检测到31个真菌，分别属子囊菌门、担子菌门和新丽鞭毛菌门，子囊菌门含量最多。杨顼等构建我国西藏自治区天然放牧马粪样的ITS克隆文库，检测到子囊菌门的Pezizales、Thelebolales、Pleosporales三个目，以及另一个盘菌纲内未确定目(Uncultured in Pezizomycetes)。Mura等通过ITS克隆文库的构建，从盎格鲁-阿拉伯马肠道样品中共检测到厌氧真菌的3个属，即、、，均隶属于Neocallimastigaceae(新美鞭菌科)，具有完整、有效的纤维素降解酶系。然而，以上DGGE、克隆文库等传统分子生物学技术具有不能完整地反映整个群落的结构信息等局限性。与之相比，高通量测序技术对微生物群落信息的采集与分析更准确、详细。

昭苏马场位于素有“天马故乡”美称的伊犁州昭苏县境内，是我国重要马产业基地，主要承担伊犁马选育的核心任务。新疆一些少数民族自古便有食用马肉的生活习惯，通常选择4～12岁伊犁马进行屠宰，然而从营养成分和人体摄入能量的角度，以及屠宰性状指标和器官重量等肉用性能的角度考虑，加之饲养管理成本的因素，5～6岁为适宜屠宰年龄阶段。另外，5～8岁年龄阶段的伊犁马竞赛技能最好。

本研究采用高通量测序技术研究以上4个年龄阶段伊犁马粪便真菌群落的组成，探讨伴随年龄增长伊犁马肠道菌群的动态变化情况，粪便是了解肠道微生物群落的重要样品，微生物占粪便的30%以上，并且新鲜粪便中绝大多数微生物是活菌，对揭示伊犁马肠道微生物的生物多样性和马肠道疾病的诊断具有重要的理论指导作用，对饲用益生菌或生物性添加剂的开发提供理论数据，对我区马产业的发展具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验动物为新疆伊犁昭苏马场 (80°51′～81°03′E，42°25′～43°15′N) 自由放牧的4岁、6岁、8岁和12岁四个不同年龄分组的雄性伊犁马匹，每组3匹，共12匹。马肠道样品为7月份采集的新鲜粪便，分别标记为ZS.4、ZS.6、ZS.8和ZS.12。

1.2 肠道微生物基因组DNA的提取

采用美国强力土壤DNA提取试剂盒(MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit)分离粪便样本全基因组，按照说明书上步骤进行。将提取得到的粪便基因组加入100μL去离子水溶解，取5μL用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测(0.5×TAE缓冲液)，检测DNA的相对浓度和质量，使用无菌水稀释DNA样本至1 ng/μL。

1.3 ITS序列的PCR扩增与测序

以稀释后的基因组DNA为模板，以ITS5-1737F和ITS2-2043R作ITS1可变区特异引物，通过高效、高保真酶进行PCR扩增。反应体系参照说明书，反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。所得到的扩增PCR产物经1%琼脂糖电泳检测合适后进行测序 (测序工作由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成)，使用New England Biolabs公司高效和高保真酶PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer进行PCR扩增，确保扩增效率和准确性，采用Illumina NovaSeq6000测序平台测序。

1.4 数据分析

利用Uparse软件对Effective Tags进行聚类，对获得的序列以97%的一致性聚类划分为OTU(Operational Taxonomic Unit)。OTUs中出现频率最高的序列选取为OTUs的代表序列，然后用QIIME软件中的blast方法与Unit(v7.2)数据库进行物种分析和注释，并分别在界、门、纲、目、科、属等分类水平上统计样本微生物群落组成。以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，基于均一化处理后的数据进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析。

利用QIIME软件计算样品包括Chao1指数和Shannon指数的α多样性值，其中群落丰富度用Chao1指数描述，其值越高表明群落物种的丰富度越高。Shannon指数可以反映样品物种的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高。

2 结果与分析

2.1 测序结果质量分析

通过对样品测序得到原始序列条数为344 827，过滤掉低质量的序列后，共获得有效序列总数为309 227。根据barcode标签进行样品序列拆分，再对初始序列进行去冗余处理后，获得16S rDNA Unique Reads，并将其聚类为用于物种分类的OTU，统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信息，四组样品共产生89～132个OTU，有效序列比例均大于74%以上，各样品的相关数据如表1所示。

稀释曲线能够可直接反映出测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多数据量只会产生少量新物种(OTUs)从稀释曲线(图1)中可知，序列数量到75 000时各样品稀释曲线均基本趋于平缓，说明取样基本合理，真实环境中细菌群落结构的置信度较高，能够比较真实地反映样本微生物群落。

2.2 各样品中真菌多样性及相关性分析

如表2所示，四组样品的4个指数，即Chao1、Ace、Shannon和Simpson指数的大小依次为ZS.6>ZS.4>ZS.8>ZS.12，说明物种多样性和丰富度在ZS.6最高，而在ZS.12中最低。Shannon和Simpson指数4个年龄组间统计差异较显著(<0.05)，而Chao1和Ace指数统计差异不显著(>0.05)。

表1 样品测序数据统计Table 1 Sequencing data statistics

图1 相似度为0.97条件下各样品组的稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curves of each group at cut-off level of 3%

在0.97的相似度下，得到了每个样品的OTU个数，利用R软件绘出韦恩图，分析不同样本组之间共有、特有的OTU数目，直观展示样品间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。如图2所示，4组共有的OTU数量为43。每组特有的OTU数量占总OTU数量的比例依次为ZS.4(35.8%)>ZS.6(22.7%)>ZS.8(19.1%)>ZS.12(5.6%)，说明随着年龄的增加肠道微生物特有微生物的数量逐渐减少。

表2 各组真菌多样性指数Table 2 Diversity indices of fungi in each group

2.3 肠道菌群组成分析

比较不同年龄伊犁马肠道优势菌门、科、属的相对丰度可知，随着成年伊犁马的年龄增长，其优势菌的相对丰度均发生变化。

本试验中共检测到4个真菌门分类物种，分别为Ascomycota (子囊菌门)、Basidiomycota (担子菌门)、Neocallimastigomycota (新美鞭菌门)、Mucoromycota (广古菌门)，所占比例如图3。

ZS.4中相对丰度大小依次为Ascomycota> Basidiomycota> Neocallimastigomycota >Mucoromycot，Ascomycota的OTU数量占的比例最高，占30.1%，该门类在4岁马肠道中相对丰度在四组样品中最高，并随着年龄的增加逐渐减少。在ZS.6、ZS.8和ZS.12作为最优势门类的Basidiomycota在该三组随年龄增加而逐渐减少。Neocallimastigomycota在4岁马肠道中的丰度较高，为8.3%，而其余3个年龄伊犁马肠道中均较低。未知菌类随着年龄的增加显著增高。

图2 四个样品组中真菌多样性的相关性分析Fig. 2 The similarity analysis of fungaldiversity among four groups

在科的水平上，总共47个类群被分类，其中最优势菌为Cryptococcaceae和Pichiaceae，其次是Neocallimastigaceae、Sporormiaceae、Aspergillaceae、Lasiosphaeriaceae、Didymosphaeriaceae等。Pichiaceae在4岁马肠道中最高，随年龄增加逐渐减少，在12岁马肠道中极少。Cryptococcaceae 科的相对丰度为ZS.6>ZS.4>ZS.8>ZS.12，从6岁开始逐渐减少。Neocallimastigaceae在4岁伊犁马肠道中明显高于其他三组。未知菌类随着年龄的增加呈显著增高趋势，如图4。

图3 不同年龄成年伊犁马门水平上肠道微生物相对丰度Fig. 3 Relative abundances of fungi in intestineof different age groups at phylum level

图4 不同年龄成年伊犁马科水平上肠道微生物相对丰度Fig. 4 Relative abundance of fungi in intestine ofdifferent age groups at family level

在属的水平上共检测到56个被分类的真菌，其中优势菌为和，的比例随年龄的增加而明显减少，随着年龄增加呈逐渐减少。在ZS.4中丰度较高。未知菌类占的比例随年龄增加逐渐提高，在ZS.12中达到83.6%，如图5。

图5 不同年龄成年伊犁马属水平上肠道微生物相对丰度Fig. 5 Relative abundance of fungi in intestine ofdifferent age groups at genus level

3 讨 论

肠道菌群寄居在机体肠道中，是由细菌、真菌、古生菌、原生动物等相互协同、相互制约构成的，庞大而又复杂的微生物体系，数量惊人，种类非常多，不同的微生物群体发挥着不同的功能，直接参与宿主的食物消化、营养吸收、能量代谢、免疫应答等诸多机体的生理功能。肠道菌群可以通过代谢活动维持动物肠道的健康以及动态平衡。与细菌相比，肠道内的真菌数量和种类较少，但对肠道动态平衡的维持也同样起重要作用。肠道内的真菌与细菌之间具有密切关系，通过互利共生、拮抗等关系，支持和保护彼此的生长发育。肠道菌群群落结构可受到来自宿主方面的很多因素的影响，如不同类型食物的摄入、年龄的增长、抗生素的使用情况以及宿主的健康状况等，另外也受到生活地域、季节和饲养条件等很多环境因子的影响，其中宿主的年龄的差异明显影响肠道菌群结构。本研究采用ITS1测序方法对伊犁马肠道菌群群落结构进行分析，初步揭示伊犁马肠道真菌菌群结构，为更深入了解伊犁马肠道微生物结构，以及预防和检测疾病奠定基础。

本试验四组样品Shannon和Chao1指数的数据显示真菌群落物种多样性和物种丰度随年龄先有增加，后有减少的趋势。对同样四组样品中真菌Shannon和Chao1指数的分析显示，真菌群落物种多样性随年龄增加而减少，而细菌物种丰富与年龄无相关性(数据未发布)。综合以上结果可知，导致真菌多样性和群落丰度的这种变化趋势的主要因素是马年龄，而不是细菌群落变化。

本研究发现伊犁马肠道真菌的优势菌为Ascomycota、Basidiomycota、Neocallimastigomycota、Mucoromycota。研究表明Ascomycota、Basidiomycota在家牛、绵阳、山羊、家兔等草食动物粪便中均为优势菌。另外，华彦等通过高通量测序证明华北豹肠道中真菌以Ascomycota数量最多，其次为Basidiomycota和Mucoromycota。艾生权等采用RFLP法分析结果显示亚成体大熊猫肠道真菌主要为Ascomycota、Basidiomycota 2个门。Mura等通过试验证明盎格鲁-阿拉伯马肠道厌氧真菌中Neocallimastigomycota最数量多。这些研究结果表明，在以上的几种动物类群间，其肠道真菌菌群结构在门水平上有相似之处。

本研究发现在属的水平上，伊犁马肠道中的优势菌为(隐球酵母菌属)和(毕赤酵母属)。4岁马肠道中Pichia相对丰度最高，其次是，而6岁、8岁和12岁马肠道中相对丰度最高，其次为Pichia。

圆形或椭圆形、胞外具有荚膜结构的一种真菌，该属已被分类的种有37个，其中除了、和等少数几种之外，其他成员对人类没有致病性。本试验数据中隐球酵母菌相关序列均属于未知菌类，未发现以上几种真菌相关DNA序列。多数可将甲醇作为唯一碳源和能源生长繁殖，可能对降低肠道中甲醇含量具有一定作用。有报道表明酵母菌含有维生素、酶等物质，对动物肠道的微生物平衡具有很强的恢复能力，可以提高动物的生产性能，现阶段被广泛应用于饲料工业上。本研究发现随成年伊犁马年龄的增长，以上两种酵母菌的相对丰度下降，这也从真菌的角度说明，成年伊犁马4～6岁为对营养物质的消化能力最强的年龄阶段。是一种反刍动物瘤胃中最重要的厌氧真菌，不仅具有降解纤维素，还具有降解蛋白质和淀粉等物质的能力，因此在饲料消化过程中起重要作用。在4岁伊犁马粪便中的相对丰度较高，该数据同样支持成年阶段中4～6岁伊犁马消化能力最强。本研究数据中属于的OTU基本上都是。相关研究表明为反刍动物消化道中较普遍的厌氧菌，对纤维饲料水解作用是通过产生纤维素酶来进行。

4 结 论

比较不同年龄成年伊犁马肠道优势菌门、科、属的相对丰度可知，随着成年伊犁马的年龄增长，其优势菌的相对丰度均发生变化。本研究对新疆地区成年伊犁马粪便真菌组分进行了分析，揭示了伊犁马肠道菌群的多样性，为更深入地了解伊犁马真菌群落结构奠定了一定的基础。