丹参酮IIA 调节肝脏HNF1α-Fxr 信号通路抑制小鼠非酒精性脂肪肝进程

喻春辉，李双，江振峰，蔡丛雯

（江西省南昌市第一医院1.内镜中心；2.老年科；3.江西神州司法鉴定中心，南昌 330008）

非酒精性脂肪性肝病 (Non-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD)已成为全球最常见的慢性肝病，全世界约25%的人群患有NAFLD，包括儿童、青少年及老年人[1-2]。 NAFLD 包括非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver, NAFL)、 非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis , NASH)、非酒精性脂肪性肝纤维化及肝硬化[3]。NAFLD 早期表现为NAFL，其主要特征为肝脂肪变性。 随着疾病的发展，可发生肝细胞气球样变性和肝小叶间炎症。当肝脏持续发生脂肪变性、肝脏炎症，形成肝纤维化时，NAFLD 进入进展期，表现为非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化。 NAFLD 进入中晚期后可发生肝硬化甚至肝癌[4-6]。 流行病学和临床研究表明，NASH 是肝硬化和肝恶性肿瘤等终末期肝病的致病因素。 肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症及高血压等疾病与NAFLD 疾病发生密切相关[7-8]。

NAFLD 的早期诊断缺乏特异性，导致NAFLD的治疗仍没有一个统一的标准。 近年来，国内外研究多集中于NAFLD 的早期干预靶点及分子机制探讨。 中药抗NAFLD 研究正受到国内外肝病研究者的重视。 研究表明中药丹参具有抗氧化应激、抗细胞炎症、抑制细胞凋亡、促进细胞再生等生物学作用[9-12]。丹参酮IIA 是丹参的脂溶性有效成分。研究发现丹参酮IIA 具有改善急慢性肝病损伤、抗氧化应激以及抗肿瘤作用[13-15]。 但对于丹参酮IIA抗NAFL 疗效及其分子机制尚无报道。

本研究通过高脂饮食诱导小鼠NAFL 形成，然后给予丹参酮IIA 灌胃治疗， 观察丹参酮IIA 抗NAFL 疗效，并探讨内在分子生物学机制。

1 材料和方法

1.1 NAFL 小鼠模型建立及丹参酮IIA 疗程 6 周龄C57BL/6 雄性小鼠购自中国科学院上海实验中心，饲养于南昌大学医学院动物实验中心。 C57BL/6 小鼠随机分为两组， 分别为正常饮食组(Chow组，n=8)，高脂饮食组(HFD 组，n=16)。 正常饲料或高脂饲料(南通特洛菲有限公司)喂养8 周后，将HFD 组小鼠随机分为两组， 分别为HFD 组(n=8)，HFD+Tanshinone IIA 组(n=8)。HFD+Tanshinone IIA 组给予丹参酮IIA[23.1 mg/（kg·d），溶于10 mL/kg 生理盐水][16]灌胃治疗8 周。 而Chow 组及HFD 组给予生理盐水灌胃处理8 周。16 周处死所有小鼠，采集小鼠血液及肝脏。所有动物实验均经南昌市第一医院伦理委员会批准。

1.2 组织学与免疫组织化学 4%多聚甲醛及10%中性甲醛固定小鼠肝脏，分别行冰冻切片及石蜡切片。H&E 染色进行小鼠肝脏组织病理学检查。油红O 染色检测小鼠肝脏脂滴沉积。 天狼星红染色检测小鼠肝脏胶原沉积。根据NAS 评分标准[17]，对NAFL 小鼠肝脏组织病理学进行脂肪变性评分，气球样变评分，小叶间炎症评分，以及NAS 总评分。利用IMAGE-PRO Plus 6.0 软件对油红O 染色及天狼星红染色阳性面积百分比进行半定量。

按照标准程序对小鼠肝脏石蜡切片进行免疫组织化学染色。 二甲苯脱蜡， 梯度酒精水合，3%H2O2除去内源性过氧化物酶，抗原修复后，予α-SMA (ab5694, Abcam 公司)及F4/80 抗体(30325,CST 公司) 孵育，4 ℃冰箱过夜。次日给予组化二抗(GK500710, Gene Tech 公司)室温孵育1 h。 然后用EnVision Detection Rabbit/Mouse Kit (GK500710,Gene Tech 公司)进行染色。 最后苏木素染核，中性树脂封闭，显微镜观察并拍片。

1.3 实时荧光定量PCR 采用标准TRIzol 法(Invitrogen, Carlsbad, CA) 提取小鼠肝脏总RNA。以1 μg 总RNA 为模板，PrimeScript RT Master Mix(Takara, Tokyo, Japan)在37 ℃15 min， 85 ℃30 sec合成cDNA。 然后通过SYBR Green PCR 试剂盒(Takara, Tokyo, Japan)进行荧光定量PCR 反应。 所用引物列于表1 中。 所有实验重复3 次。

表1 qRT-PCR 检测所需的引物序列

1.4 Western blot 检测 采用蛋白Lysis buffer (pH 6.8 Tris-Hcl, 20% SDS, 100%甘油+PMSF) 提取NAFL 小鼠肝脏总蛋白。 使用BCA 蛋白测定试剂盒(Beyotime, 北京) 测定小鼠肝脏蛋白浓度。 10%SDS-PAGE 凝胶电泳肝脏蛋白样品，然后电转至硝基纤维素膜(NC, HAHY00010, Millipore)。 5%脱脂牛奶 (PBST 配制) 封闭NC 膜2 h， 之后予一抗4℃孵育过夜，再予驴抗鼠或驴抗兔二抗(IRDye 700 or 800, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) 室温孵育NC 膜1 h， 最后Odyssey 成像系统 (LICOR Biosciences) 扫膜并计算目的条带密度值。 所使用的一抗包括：Col1A1 (BA0325, Boster, Wuhan,China),TLR4(sc-293072,Santa Cruz Biotechnology),HNF1α(89670，CST)，Fxr(ab129089，Abcam)和GAPDH(BSAP0063, Bioworld)。

2 结果

2.1 丹参酮IIA 抑制小鼠NAFL 进程 NAFL 小鼠给予丹参酮IIA 治疗8 周后，实验结果显示，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠体重显著减轻（P<0.05）。与HFD 组相比较，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝重及肝重—体重比均显著降低 （P<0.05 or P<0.01）。 肝脏HE 染色结果显示， 丹参酮IIA 治疗后显著抑制肝脏脂肪样变性， 降低肝脏NAS 评分（P<0.05 or P<0.001）。 与肝脏HE 结果相一致，肝脏油红O 染色结果显示，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏红色脂滴明显减少（P<0.01）。

2.2 丹参酮IIA 抑制NAFL 小鼠肝脏脂质代谢 小鼠肝脏脂质代谢相关基因qPCR 检测结果显示，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏脂质代谢明显降低（P<0.05 or P<0.01）。 与HFD 组相比较，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏胆固醇合成显著减少（P<0.05）。 丹参酮IIA 治疗后显著降低小鼠肝脏脂肪酸吸收（P<0.05）。进一步行脂肪酸氧化基因检测，结果显示丹参酮IIA 治疗显著改善肝脏脂肪酸氧化反应（P<0.05 or P<0.01）。

2.3 丹参酮IIA 改善NAFL 小鼠肝脏炎症 行NAFL 小鼠肝脏炎症相关检测。 结果显示，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组 小 鼠 肝 脏TLR4 mRNA 及蛋白表达水平均显著下调，减轻小鼠肝脏炎症反应（P<0.05）。 炎性因子qPCR 结果显示，与HFD 组相比较，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏IL-6、IL-1β 以及TNFα mRNA 表达均显著下调（P<0.05）。 F4/80 免疫组化检测结果显示， 相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组 小 鼠 肝 脏F4/80蛋白表达显著减少 （P<0.05）。 以上结果表明Tanshinone IIA 治疗8 周显著抑制NAFL 肝脏炎症因子表达，减少单核巨噬细胞浸润，改善肝脏炎症。2.4 丹参酮IIA 对NAFL 小鼠肝纤维化进程无影响 行NAFL 小鼠肝纤维化相关检测。 实验结果表明，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏天狼星红染色红色胶原沉积无显著降低 （P>0.05）。 进一步行小鼠肝脏α-SMA 免疫组化检测，结果表明丹参酮IIA 对降低NAFL 小鼠肝脏α-SMA 蛋白表达作用不明显（P>0.05）。 Western blot结果显示，与HFD 组相比较，HFD+Tanshinone IIA组小鼠肝脏Col1A1 蛋白表达无明显降低 （P>0.05）。 与上述结果相一致，qPCR 检测显示丹参酮IIA 未能明显降低α-SMA 及Col1A1 mRNA 表达水平（P>0.05）。以上结果表明，丹参酮IIA 对NAFL小鼠肝纤维化进程无影响。

2.5 丹参酮IIA 激活NAFL 小鼠肝脏HNF1α-Fxr信号通路 HNF1α-Fxr 信号通路能够调控肝细胞脂肪酸转运，抑制肝脏脂肪酸结合，在肝脏脂质代谢中发挥至关重要的作用[18]。 结果显示，相对于HFD 组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏HNF1α及Fxr mRNA 表达水平均显著上调 （P<0.05）。 与qPCR 结果相一致，Western blot 结果显示，与HFD组相比较，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠肝脏HNF1α及Fxr 蛋白表达水平均显著增加（P<0.01）。 以上结果表明， 丹参酮IIA 可显著激活NAFL 小鼠肝脏HNF1α-Fxr 信号通路。

3 讨论

依据文献报道[19]， 我们利用60%高脂饲料喂养小鼠建立小鼠NAFL 模型。 HFD 喂养8 周后，NAFL 组小鼠体重增加，体型圆润，肝脏可见脂质沉积， 无气球样变性及肝小叶间炎症， 提示小鼠NAFL 模型成功建立。 再给予丹参酮IIA 灌胃治疗，据文献报道[16]，丹参酮IIA 治疗剂量按小鼠体重，23.1 mg/（kg·d）, 溶于10 mL/kg 生理盐水，灌胃，每日1 次。 丹参酮IIA 治疗8 周后，相对于HFD组，HFD+Tanshinone IIA 组小鼠体重减轻， 肝重及肝重/体重比下降。丹参酮IIA 治疗显著降低NAFL小鼠肝脏脂质沉积，改善脂质代谢及胆固醇代谢。

根据文献报道NAS 评分标准[17]，小鼠属于NAFL期， 尚未进展至NASH 期。 研究表明随着NAFLD疾病进展，肝脏炎性因子表达上调，肝脏单核巨噬细胞浸润显著增加[20-21]。 实验结果表明，丹参酮IIA可显著下调IL-6 及TNFα mRNA 表达水平， 抑制F4/80 蛋白表达，改善NAFL 小鼠肝脏炎症。 进一步行肝脏肝纤维化相关指标检测， 结果显示丹参酮IIA 对NAFL 小鼠肝纤维化进程无显著影响。因此，我们的结果表明丹参酮IIA 可改善NAFL 小鼠肝脏脂肪变性，减轻肝脏炎症浸润，而对肝脏纤维化进程无影响。

研究表明，HNF1α 可以调节肝脏脂质代谢。肝脏HNF1α 蛋白异常表达可抑制肝脏脂肪酸结合蛋白的功能，破坏肝细胞中脂肪酸的转运功能，导致肝细胞脂质沉积[18]。 HNF1α 全身小鼠表现为肝脏脂肪酸结合蛋白表达显著下调， 肝脏脂质沉积，小鼠NAFLD 形成[22]。HNF1α 可以直接与肝脏Fxr 转录因子结合，调节Fxr 转录表达，影响肝脏脂质代谢及胆固醇代谢[23]。 肝脏HNF1α-Fxr 信号通路在肝脏炎症及脂质代谢中起关键作用。 小鼠体内实验证实，激活HNF1α-Fxr 信号通路可调节肝脏胆汁酸代谢， 抑制胆固醇结石形成[24]。HNF1α-Fxr 信号通路激活可以抑制肝脏TNFα 和IL-6 的表达水平，减轻胆汁淤积性肝损伤[25]。 研究发现，丹参酮IIA 治疗后可显著上调肝脏HNF1α-Fxr mRNA 及蛋白表达水平，激活肝脏HNF1α-Fxr信号通路。

综上所述，丹参酮IIA 可通过激活NAFL 小鼠肝脏HNF1α-Fxr 信号通路， 从而抑制小鼠NAFL进程，改善NAFL 小鼠肝脏炎症，以及抑制肝脏脂质代谢。为临床上丹参酮IIA 治疗NAFL 病人提供理论依据。