血清HIF-1α、sFas、Livin在老年VaD中的表达及临床意义

戈念念，闫向敏，闫如冰，刘建军

（商丘市第四人民医院神经内科，河南商丘 476000）

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是因脑损伤引起的高级神经认知功能障碍为主的综合征，临床表现为不同程度的认知、社会等功能的下降[1,2]。当前，VaD的诊断主要依赖于病史、临床表现和影像学检查等，但此病早期症状隐匿，临床常未能及时发现和诊断，导致病情进展。因此，明确与VaD发病密切相关且敏感的指标，对延缓疾病进展和改善预后具有重要作用[3]。血清低氧诱导因子（hypoxia-Inducible factor-1，HIF-1α）是一种受细胞内氧含量调节的的蛋白因子，当组织缺氧时，血清HIF-1α会升高以保持机体的氧平衡[4]；可溶性细胞凋亡因子（soluble fas，sFas）能够游离在外周血液中且不具有活性，可抑制凋亡的发生，有研究显示其可能参与了VaD细胞凋亡的过程[5]。凋亡抑制蛋白抗体（Livin）是新发现的一种细胞凋亡因子，以Livin为靶点的抑制物可以发挥抑制细胞凋亡的作用，有报道称，因炎症刺激，Livin低表达参与了血管性痴呆的疾病进展[6]。为指导临床诊治，本研究将对上述因子在老年VaD中的表达及临床意义进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年8月～2020年10月商丘市第四人民医院收治的老年血管性痴呆患者57例作为研究对象。本研究经过伦理委员会许可进行。诊断标准：经MRI检查结合临床症状确诊为VaD[7]。纳入标准：（1）符合上述诊断；（2）无意识、精神障碍或其他器官组织严重病变；（3）患者及家属知情同意。排除标准：（1）肝肾功能不全或器官损伤者；（2）自身免疫性疾病或肿瘤患者；（3）影响认知功能的其他疾病。正常健康人为对照组20例，男11例，女9例；年龄60～75岁，平均年龄（67.58±5.74）岁；观察组患者57例，男28例，女29例；年龄60～76岁，平均年龄（67.92±5.88）岁；根据临床痴呆评定量表（clinical dementia rating，CDR）[8]分为轻度痴呆16例，中度痴呆19例，重度痴呆22例。对上述一般资料进行对比，差异不具有统计学分析意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清HIF-1α和Livin水平：采集患者空腹静脉血5ml，凝固30min后使用血液离心机[翊诺科技(上海)有限公司，TD4X]以3000r/min离心处理10min后，分离血清保存于冰箱中备用。使用ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）测定血清中HIF-1α和Livin水平。采用双抗体夹心酶联免疫法（试剂盒厂家同上）测定标本中sFas水平，采集患者空腹静脉血5ml，置于温度为37℃的电热恒温水箱中热浴30min，离心处理后取血清3ml进行sFas的测定，测试方法如下：使用纯化的人可溶性细胞凋亡因子抗体包被微孔酶板，将需要测试的血清加入至包被单抗的微孔中，使sFas与辣根过氧化物酶标记的sFas抗体相结合形成抗体-抗原-酶标抗体的复合物，彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺与之结合显色，四甲基联苯胺在辣根过氧化物酶催化下转换成蓝色，在酸的作用下最终转化成黄色，颜色的深浅和样品中的sFas浓度呈正相关。最后使用酶标仪[美谷分子(上海)有限公司，SpectraMax iD5]在450nm波长下进行吸光度的测定，通过绘制标准曲线从而计算所测血清中的sFas浓度。上述操作均严格按照试剂盒操作使用说明书进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，计量数据比较采用独立样本t检验，相关性检验使用Speraman等级相关性分析法，多组计量数据比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清HIF-1α、sFas和Livin在老年VaD患者中的表达

观察组患者HIF-1α、sFas较对照组升高，Livin较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 老年VaD患者与对照组HIF-1α、sFas和Livin的水平比较

表1 老年VaD患者与对照组HIF-1α、sFas和Livin的水平比较

与对照组相比*P＜0.05

组别 HIF-1α（pg/mL） sFas（μg/L） Livin（nmol/mL）观察组（n=57） 498.72±52.98* 220.18±12.46* 7.22±2.16*对照组（n=20） 155.48±50.24 148.97±10.97 12.82±2.54

2.2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同严重等级老年VaD患者中的情况

3组患者的HIF-1α无明显差异（P＞0.05），sFas和Livin水平在重度痴呆患者中的表达较轻中度明显降低（P＜0.01），且重度患者sFas和Livin水平较中度痴呆患者水平降低（P＜0.05），见表2。

表2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同严重等级老年VaD患者中的比较

表2 血清HIF-1α、sFas和Livin在不同严重等级老年VaD患者中的比较

与中度相比*P＜0.05，与轻度相比#P＜0.05

ISS分期 HIF-1α（pg/mL） sFas（μg/L） Livin（nmol/L）轻度（n=16） 462.28±88.42 244.77±67.42 9.82±3.14中度（n=19） 486.77±89.61 220.89±64.33 8.01±2.89重度（n=22） 504.87±89.92 170.29±51.64*# 3.54±1.62*#

2.3 血清HIF-1α、sFas和Livin与老年VaD分级的关系

运用Speraman 等级相关性分析方法，结果显示HIF-1α的水平与VaD分级无明显相关性（r=0.159，P＞0.05），见图1A；sFas和Livin与VaD分级呈负相关（r= -0.482、-0.481，P值均小于0.05），见附图。

附图 血清HIF-1α、sFas和Livin与老年VaD分级的相关图

2.4 血清HIF-1α、sFas和Livin指导老年血管性痴呆分级的ROC分析

经过ROC曲线分析，血清HIF-1α、sFas和Livin对VaD分级均有较高的效能。Livin截断值为7.46nmol/mL时诊断效能较高，其约登指数为0.821，曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.821，敏感度、特异性分别为83.33%、90.91%，见表3。

表3 血清HIF-1α、sFas和Livin指导老年血管性痴呆分级的ROC分析

3 讨论

有报道显示，血管性痴呆占60岁以上老人认知障碍病因的20%，对老年病患的身心健康和家庭成员的生活造成较大的负担[9,10]。因此，明确敏感高效的指标对老年VaD的早期诊治和延缓疾病进展尤为重要。本研究数据显示，老年VaD患者血清HIF-1α和sFas水平较对照组高，血清Livin水平较对照组低，HIF-1α水平与CDR分级无明显关系，sFas和Livin水平与CDR分级呈负相关，且sFas水平在VaD发病起始会较正常人明显升高，随着疾病进展，sFas在到达一定的峰值之后会随着脑神经功能损伤的加剧逐渐降低。说明血清HIF-1α、sFas和Livin参与了血管性痴呆疾病的发生、发展，血清sFas和Livin含量随着疾病进展而降低。分析原因为，HIF-1α作为缺氧诱导家族中最先被发现的诱导蛋白因子，当脑组织缺血缺氧刺激时，机体应激反应机制通过上调HIF-1α的水平来实现自我保护，并通过调控其下游靶基因之一的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与脑保护功能的调节过程，VEGF可以发挥促进血管再生的作用[11]，同时在一定程度上改善脑组织缺血状态，进而起到保护神经的作用。而HIF-1α与痴呆严重程度无明显关系，考虑是VaD患者脑组织长期处于缺血缺氧状态，使得缺血低氧诱导保护机制处于较低水平。细胞凋亡在病理生理过程中表现为一种主动性的细胞自杀形态，与胚胎形成和衰老病变损伤细胞的清除关系十分密切，Singh等[12]的研究也表明，细胞凋亡活动异常会导致疾病的发生和进展，与本研究观点一致。脑组织缺血缺氧刺激后产生诸多细胞因子，激活并上调细胞凋亡因子及其配体，促进了神经细胞的凋亡，所以老年VaD患者的sFas水平较健康人更高[13]。sFas游离在外周血液中，可以选择性的剪切细胞凋亡因子相关区域氨基酸残基的产物，通过与配体结合，阻断其与细胞膜上的细胞凋亡因子结合，抑制细胞凋亡的发生。因此，血管性痴呆的的发生可能与sFas抑制细胞凋亡有关[14]。随着痴呆程度的加重，sFas保护性因子水平降低，抑制受损伤的神经细胞凋亡并加重疾病进展，故其水平随着疾病进展和认知障碍的加剧而降低，与痴呆严重程度呈负相关。Livin是新近被发现的一种细胞凋亡因子，可以通过直接抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性发挥抑制凋亡作用，还可以直接与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）前体蛋白以及它的激活形式结合并抑制其活性，阻断caspase-3对pro-caspase9的反馈性激活，从而发挥抑制细胞凋亡的作用[15]。因此，Livin在炎症因子刺激下的低表达水平同样参与了血管性痴呆的进程，随着病情加重，脑细胞因缺血缺氧受损程度加重使得sFas和Livin水平降低，导致细胞凋亡异常，进一步促进疾病进展。

本研究中，血清HIF-1α、sFas和Livin指导老年CDR的ROC分析结果显示，血清HIF-1α、sFas和Livin对VaD分级均有较高的效能，Livin对CDR轻中度与重度分级有明显的诊断鉴别意义，说明血清Livin水平对CDR分级诊断指导意义更大。分析其原因，一是Livin可以在Fas/caspase-8诱导的死亡受体的过程中抑制核心蛋白酶caspase-3的活性，从而抑制死亡途径发挥抑制细胞凋亡的作用；二是Livin在线粒体途径阻断caspase-3对pro-caspase9的激活，从而抑制细胞凋亡。血管性痴呆患者的Livin降低，且与体内炎性因子白细胞介素-18与γ干扰素呈负相关，反映Livin在炎症刺激下参与VaD的发生，随着疾病进展，机体应激刺激加重，体内炎性因子分泌增多，进而使得Livin降低。

综上所述，老年VaD患者血清HIF-1α水平存在一定程度的升高，但与痴呆严重程度无明显相关性，同时sFas、Livin随着痴呆程度的加重而降低，且与痴呆进展呈负相关，其中Livin对于CDR分级更具有指导意义，能够辅助指导临床VaD的诊治。