梓醇对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏的保护作用

张 翠，王继胜，王 林，胡泽波，张根葆*

（1.皖南医学院病理生理学教研室，安徽芜湖 241002；2.皖南医学院）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）作为导致终末期肾脏疾病的主要因素之一，其发病机制仍未阐明。在其复杂的机制中，炎症反应可能占据重要地位[1]。糖尿病状态下，多种炎症因子被激活，加速DN的发展。髓系相关蛋白MRP8（S100A8）是S100家族的一员，多以异源二聚体S100A8/A9的形式发挥功能。目前，S100A8/A9的研究报道多见于炎症性疾病及肿瘤方面，而在糖尿病及其并发症方面的研究较少[2]。

梓醇是从地黄根部分离提纯的一种糖苷，具有降低血糖、抗炎、抗氧化损伤、降血脂等多种作用。已有研究证实，梓醇能延缓糖尿病肾组织结构和功能的早期病变，在一定程度上对DN起到防治作用[3]，但具体机制尚未阐明。本研究通过检测糖尿病大鼠肾脏S100A8、TLR4、NF-κB蛋白的表达情况及相关生化指标的改变，探讨梓醇对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 24只雄性SD大鼠，体重180～210g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.1.2 主要试剂 链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自美国Sigma公司；梓醇购自南京景竹生物科技有限公司；兔抗鼠TLR4抗体、兔抗鼠S100A8抗体、兔抗鼠NF-κB抗体购自安徽奈彻生物科技有限公司；免疫组化试剂盒，HRP山羊抗兔二抗为武汉赛维尔生物科技有限公司产品；血糖检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司，血肌酐、考马斯亮蓝检测试剂盒均为南京生物建成研究所产品。

1.2 方法

1.2.1 复制模型 动物适应性喂养1周后，随机分出正常对照组大鼠8只，其余大鼠禁食12h后，腹腔注射60mg/kg溶于无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH=4.5）的STZ，正常对照组注射等量的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，72h后测空腹血糖，血糖值大于等于16.7 mmol/L的动物视为糖尿病模型复制成功。

1.2.2 大鼠分组 共将大鼠分为3组，除正常对照组大鼠外，将糖尿病模型复制成功的大鼠随机平均分为2组，即糖尿病模型组和梓醇干预组，每组8只。正常对照组：生理盐水2ml/d；糖尿病模型组：生理盐水2ml/d；梓醇干预组：梓醇10mg/kg·d灌胃。

1.2.3 动物标本的收集 各组动物饲养至6周处死，处死前禁食12h，麻醉后腹主动脉穿刺取血，4℃离心取上清，取双侧肾脏，计算肾重与体重比值，一侧肾脏固定于4%中性甲醛溶液，制作石蜡切片供免疫组织化学及形态学检测使用；另一测肾脏于-80℃冰箱保存，供其他生化指标检测。

1.2.4 大鼠空腹血糖、血肌酐、尿蛋白的检测 空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法检测，尿蛋白含量用考马斯亮蓝法测定，血肌酐采用肌氨酸氧化酶法测定。

1.2.5 免疫组织化学检测 肾组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，用链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶法检测肾组织S100A8、TLR4、NF-κB活性，以PBS为一抗做阴性对照，DAB染色，苏木素复染。采用Image-Pro plus 6.0型图像分析软件进行分析，每张切片随机选取5个视野（×400），蛋白表达量以每个视野积分光密度均值表示，越高表示蛋白表达越强。

1.2.6 形态学检测 采用HE染色，光镜观察大鼠肾组织形态学改变。

1.2.7 统计学分析 所有研究数据均应用SPSS 18.0统计软件进行分析和处理。计量资料用均数±标准差表示，两组间差异显著性比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏指数的比较

糖尿病模型组大鼠逐渐出现“三高一低”的典型表现，体重较正常对照组减轻，肾重体重比值明显增大，且随着病程的延长更加明显；梓醇干预组上述表现有所减轻，且肾重体重比值较模型组明显下降，见表1。

表1 各组大鼠肾脏指数的比较

表1 各组大鼠肾脏指数的比较

与正常对照组比较，*P＜0.01；与糖尿病模型组比较，#P＜0.01

组别 肾重(g) 体重(g) 肾重/体重(mg/g)正常对照组 2.23±0.16 361.63±19.76 6.18±0.40糖尿病模型组 2.14±0.22 179.63±17.64* 11.95±1.21*梓醇治疗组 2.20±0.24 258.88±26.63# 8.50±0.61#

2.2 各组大鼠生化指标的检测

如表2所示，相比对照组，模型组大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白量明显增高，而梓醇干预组3个指标均明显下降。

表2 各组大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白的比较

表2 各组大鼠空腹血糖、血肌酐、24h尿蛋白的比较

与正常对照组比较，*P＜0.01；与糖尿病模型组比较，#P＜0.01

组别 血糖（mmol/L） 血肌酐(μmol/L) 24h尿蛋白(mg)正常对照组 5.87±0.99 69.07±10.01 4.17±1.79糖尿病模型组 21.71±3.96* 157.87±23.37* 59.48±15.70*梓醇治疗组 15.90±3.53# 117.32±21.21 # 30.45±9.03#

2.3 各组大鼠S100A8、TLR4、NF-κB的表达情况比较

正常对照组大鼠肾组织S100A8、TLR4、NF-κB均有少量表达，糖尿病模型组大鼠肾脏3种蛋白的表达量均明显增加，而梓醇干预组3者表达量均有所下降，见表3，图1。

表3 各组肾组织S100A8、TLR4、NF-κB的表达水平比较

图1 各组S100A8、NF-κB、TLR4蛋白在肾组织中的表达（×400）

2.4 各组肾组织形态学比较

糖尿病模型组上皮细胞空泡变性，脱落，肾小管扩张，基底膜破坏，肾小球明显充血。梓醇干预组肾脏基底膜完整，破坏程度较轻，肾小球和肾小管结构接近正常，如图2。

图2 各组肾组织形态比较（HE，×400）

3 讨论

DN最基本、最突出的特征之一是肾脏纤维化，而导致肾脏纤维化发生发展的主要原因之一就是炎症，其在DN发展中发挥着不可替代的作用[4,5]。TNF-α、IL-18、IL-1β和MCP-1等促炎因子在DN中特异表达，引发炎症瀑布反应，产生大量氧自由基，导致肾脏结构损伤[6,7]。因此，阻断炎性激活通路可能对防治DN具有重要意义。现已发现，梓醇既能降低糖尿病的血糖水平，又能很好的控制糖尿病并发症，但其机制尚未阐明。本研究采用梓醇作为治疗药物，结果显示，治疗组的空腹血糖明显减低，肾脏指数下降，且蛋白尿及血肌酐水平明显降低，HE染色显示肾脏损伤亦减轻，说明其对DN具有一定的保护作用。

S100A8蛋白在炎症条件下表达上调，已成为新的炎症介质标记物。在应激等因素作用下，炎症细胞受到S100A8的刺激后，能够产生和释放炎症介质，参与机体炎症反应调节。研究表明，S100A8/A9的浓度随着糖尿病视网膜病变程度的加重而增加，提示S100A8/A9浓度可能反映视网膜病变的严重程度[8]。有研究显示，S100A8除了在炎症过程中起作用外，还可能在DN的病理生理过程中起作用[9]。在DN患者体内，蛋白尿的程度与S100A8/A9的水平呈正相关[10]。国外学者研究认为，STZ诱导的1型糖尿病小鼠肾小球中，S100A8的mRNA表达水平普遍增高[11]，这些均提示S100A8可能参与了DN的发生发展。本实验观察了各组大鼠肾脏S100A8蛋白表达情况，发现病程6周的糖尿病大鼠肾脏S100A8蛋白表达较正常组明显增多，表明S100A8与DN的发生发展有关，而梓醇干预组S100A8的表达明显减少，表明梓醇能够减少S100A8的产生，其机制可能与梓醇的抗炎抗氧化作用有关。

TLR4/NF-κB通路是介导炎症反应的关键信号通路，已有研究发现，糖尿病大鼠肾脏TLR4显著增多[12]。TLR4能诱导NF-κB活性增加，NF-κB被激活后可刺激黏附分子和促炎因子(包括MCP-1、TNF-α和IL-6)的表达[13]，从而促进DN的进展。本研究亦检测到糖尿病大鼠肾脏TLR4及NF-κB蛋白表达均显著增多，说明二者均参与了DN炎症的发生发展进程，梓醇能够通过抑制二者表达而减轻DN肾脏损害。推测在糖尿病状态下，S100A8激活后表达增多，进一步激活TLR4，以促进胞内髓样分化因子转运，使IL-1受体相关激酶-1活化[14]，进而诱导NF-κB活化[15]，分泌释放多种炎症因子，加重DN。

本实验结果提示，经梓醇治疗的糖尿病大鼠血糖降低，肾体比明显下降，结合HE染色形态学观察，提示梓醇可能通过降低糖尿病肾脏S100A8、TLR4及NF-κB蛋白的表达，进而抑制DN慢性炎症反应，以减轻糖尿病造成的肾脏损害。