雷尼酸锶对实验性牙周炎大鼠牙周组织中OPG、RANKL 影响的研究*

梁向阳 李春年

前期的动物实验研究已证实雷尼酸锶作为骨质疏松治疗药物，其辅助牙周局部治疗可减少破骨细胞的形成，起到抑制牙槽骨吸收的作用，同时可促进成骨细胞的再生，起到促进牙槽骨再形成的作用[1]。已有研究证明，骨保护蛋白OPG/ 核因子-kB 受体活化因子配体RANKL/ 核因子-kB 受体活化因子RANK 信号通路在骨的改建过程中至关重要[2,3]，在本课题前期研究的基础上，拟通过比较观察雷尼酸锶对大鼠实验性牙周炎治疗后牙周组织中骨代谢因子OPG、RANKL 的影响，更加深入地评估雷尼酸锶对牙周炎大鼠的治疗作用，为雷尼酸锶辅助牙周治疗提供科学依据。

1.材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD 大鼠50 只(3 月龄，180～200g)，在标准的环境下喂养(12h 白天/ 夜晚，22±0.1℃)，饮食均为鼠粮和自来水。(以上均由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2013-1-003，合格证编号：1607118)。

1.2 药物及试剂 雷尼酸锶(Sigma 公司，美国)；兔抗大鼠OPG 多克隆抗体、兔抗大鼠RANKL多克隆抗体、超敏二步法免疫组化检测试剂PV9000(武汉博士德生物工程有限公司，中国)。

1.3 实验方法 将50 只3 月龄雄性SD 大鼠随机分为5 组(10 只/ 组)，1)正常组，2)牙周炎组，3)牙周炎局部治疗组，4)牙周炎雷尼酸锶治疗组，5)牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组。采用正畸钢丝结扎大鼠双侧上颌第一磨牙牙颈部建立大鼠牙周炎模型。结扎4 周后，除正常组外，其余4 组各随机抽取2 只大鼠鉴定牙周炎模型，上颌第一磨牙牙龈红肿，牙周袋形成，牙槽骨吸收，说明牙周炎模型建立成功。结扎8 周后，牙周炎局部治疗组通过去除钢丝、牙周袋局部上碘甘油建立牙周炎局部治疗模型，牙周炎雷尼酸锶治疗组采取雷尼酸锶400mg/ (kg·d)灌胃建立药物治疗模型，牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组去除钢丝、牙周袋局部上药，同时雷尼酸锶灌胃。牙周炎局部治疗和药物治疗8 周后处死所有大鼠，制作牙周组织连续切片，观察牙周组织的改变情况；计量牙周附着丧失情况的变化；进行免疫组化染色，观察牙周组织中OPG、RANKL 的变化情况，评价雷尼酸锶对牙周炎的治疗效果。

1.4 组织化学切片制作与染色 将大鼠上颌骨标本浸泡于10%福尔马林中固定48h，流动水冲洗，置于PH 为7 的10%乙二胺四乙酸钠脱钙液中，4℃脱钙2 个月，脱钙成功后，修剪标本，包埋，与第一磨牙的牙体长轴平行，从近远中方向连续切片，厚约5μm。HE 染色观察牙周组织的变化。免疫组织化学染色，观察牙周组织中OPG、RANKL 指标的变化。

1.5 显微镜下组织学观察 光镜下观察所有大鼠牙周组织的形态学改变及OPG、RANKL 免疫组织化学染色情况。

1.6 显微图象分析 在光镜下，选取大鼠上颌第一磨牙远中根根中1/ 3 区牙龈及牙槽骨进行测量(×400)，在该区域随机选择3 个部位，测量其光密度值，取平均值作为该指标的平均光密度值(Average Optical Density，AOD)，用来评价牙槽骨的改变情况。

1.7 统计学分析 使用SPSS21.0 统计软件进行统计分析。实验数据均满足正态分布，采用均数±标准差()表示。数据采用单因素方差分析的方法进行检验(检验水准α=0.05，P＜0.05 表示有统计学差异)。

2.结果

2.1 牙周组织观察 正常组：牙龈颜色基本正常，未探及牙周袋；光镜下观察：牙槽嵴顶形态规则。

牙周炎组：牙龈重度红肿，探诊出血，可探及深牙周袋；光镜下观察：结合上皮向根方增殖，牙周结缔组织内可见大量的淋巴细胞浸润，牙槽骨中出现较多破骨细胞性骨吸收陷窝，固有牙槽骨吸收破坏(图1)。

图1 牙周炎组牙周形态(HE×100，黑色箭头指示破骨细胞)

牙周炎局部治疗组：牙龈轻度红肿，探诊出血，可探及牙周袋；光镜下观察：结缔组织内少量炎性细胞，牙槽骨破坏处可见大量的成骨细胞。

牙周炎雷尼酸锶治疗组：牙龈中度红肿，探诊出血，可探及深牙周袋；光镜下观察：牙周结缔组织中炎性细胞浸润，牙槽骨中可见少量的破骨细胞，牙槽骨吸收处可见较多的成骨细胞。

牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组：牙龈略红肿，探诊出血，牙周袋变浅；光镜下观察：牙周结缔组织内少量的炎性细胞浸润，牙槽骨破坏处可见较多的成骨细胞(图2)。

图2 牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组牙周形态(HE×100，黑色箭头指示成骨细胞)

2.2 大鼠牙周组织中OPG 的表达 OPG 的表达主要位于成纤维细胞和成骨细胞的细胞质中，其阳性部位为棕色或棕黄色颗粒。正常组，OPG 的表达较轻微，牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组OPG 表达均比牙周炎组表达升高，均具有统计学意义(P＜0.05)，牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组之间无统计学意义(P＞0.05)，牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组中OPG 表达明显升高，比牙周炎组、牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组表达均明显升高，均具有统计学意义(P＜0.05)(图3，表1)。

图3 大鼠牙周组织OPG 免疫组织化学染色(×400)

2.3 大鼠牙周组织RANKL 免疫组织化学染色 RANKL 的表达主要位于成纤维细胞和破骨细胞的细胞质中，其阳性部位为棕色或棕黄色颗粒。正常组，RANKL 的表达较轻微，牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组RANKL 的表达均比牙周炎组表达降低，均具有统计学意义(P＜0.05)，牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组间无统计学差异(P＞0.05)，牙周炎局部治疗联合雷尼酸锶治疗组可见RANKL 的表达较少，比牙周炎组、牙周炎局部治疗组和牙周炎雷尼酸锶治疗组表达均明显降低，均具有统计学意义(P＜0.05)(图4，表1)。

表1 各组大鼠牙周组织中OPG和RANKL表达的平均光密度值(n=10，)

表1 各组大鼠牙周组织中OPG和RANKL表达的平均光密度值(n=10，)

注：与A 组比较，*P＜0.05；与B 组比较，△P＜0.05；与C 组比较；#P＜0.05；与D 组比较，※P＜0.05。

图4 大鼠牙周组织RANKL 免疫组织化学染色(×400)

3.讨论

牙周炎是发生于牙周组织的慢性炎症性疾病，是成人牙齿缺失的主要原因之一。牙槽骨吸收是牙周炎患者牙齿丢失的主要病理机制[4]。雷尼酸锶是临床常用的抗骨质疏松药物，能够促进骨形成和抑制骨吸收，有利于骨质的形成[5,6]。本研究发现，与正常对照组比较，实验性牙周炎模型组牙槽嵴顶处骨吸收，牙槽骨中出现活跃的破骨细胞性骨吸收陷窝，固有牙槽骨破坏，提示牙槽骨破坏是牙周炎重要表现之一。HE 染色显示牙周炎局部治疗、雷尼酸锶治疗牙槽骨吸收处可见较多的成骨细胞，并且联合治疗情况明显好于单纯治疗。这与陈河林等[7]研究结果相似，提示雷尼酸锶联合治疗更有利于促进牙周炎牙槽骨骨重建，改善预后。

牙槽骨重建是成骨细胞和破骨细胞动态调节的结果，并且破骨细胞调节骨吸收的时间明显短于成骨细胞调节骨形成的时间[8]。因此，抑制牙槽骨丢失的关键是抑制破骨细胞的作用。RANKL 是破骨细胞活化增殖过程的关键分子[9]，多种刺激因素，如炎症[10]、活性氧[11]、应力改变[12]等可刺激细胞表达RANKL，与破骨细胞表面RANK 受体结合，激活破骨细胞活性。在本研究中，我们通过免疫组化的方法证实了，牙周炎大鼠RANKL 表达范围增加，并且雷尼酸锶联合治疗组RANKL 表达量明显低于单纯牙周治疗及雷尼酸锶治疗组。这一点与Pinto 等人的研究是相似的[13]。

OPG 是一种由成骨细胞分泌的糖蛋白，其发挥作用机制一方面与膜受体RANK 竞争性结合RANKL[14]；另一方面是影响RANKL 转运至胞膜，使RANKL 留在胞内[15]，减少RANKL/ RANK 信号，从而抑制骨破骨细胞激活。本研究中，我们发现，与正常对照组相比，实验性牙周炎大鼠牙周组织OPG 表达范围明显减少，牙周单纯治疗、雷尼酸锶治疗以及雷尼酸锶联合治疗均增加了OPG 表达，并且雷尼酸锶治疗联合治疗明显优于单纯治疗，这一结果支持HE 染色发现牙槽骨吸收处可见较多的成骨细胞，Marins[16]等人的发现也支持我们的结果。

综上所述，雷尼酸锶能抑制牙周炎导致的牙槽骨吸收，促进骨重建，为今后临床上采用牙周基础治疗联合雷尼酸锶改善牙周炎患者的预后提供了理论依据和实验参考。