丹瓜方对糖尿病大鼠视网膜组织MCP-1和NF-κB p65表达的影响

冯春燕，余锇香，曹俊昌，林 琳，黄苏萍，衡先培

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州 350003；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；3.福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004）

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病导致的一种常见微血管疾病，其特征主要包括视网膜水肿、渗出、出血、新生血管及增殖膜改变等，临床症状主要表现为视力进展性下降，甚至失明。流行病学数据显示，DR 患病人数在糖尿病患者中的占比约为22.3%［1］。DR 患病率与致盲率目前呈现明显的逐年上升的态势，故探究DR 的病因病机与防治的形势刻不容缓。恰如刘完素在《医方精要宣明论》中所述：“消渴一证，可变为雀目或内障”，近代医家将DR 归属于中医学“消渴目病”或“消渴内障”范畴，病位主要在肺、脾、肾，病机主要是气阴亏虚、脾肾两虚、痰瘀阻络［2］。丹瓜方是衡先培教授治疗痰瘀互结型糖尿病及其并发症的经验方，前期临床研究与动物实验证明，该方具有调节糖脂代谢紊乱、抑制炎症反应、调控氧化应激、改善糖尿病及其并发症症状的功效［3-8］，但是其疗效机制尚未完全明确，仍需深入探究。因此，本研究旨在观察丹瓜方干预糖尿病大鼠视网膜组织中单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）与核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表达的变化，进一步探讨丹瓜方防治DR 的作用机制，为课题的后续研究提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 13 周龄SPF 级自发性糖尿病（Goto-Kakisaki，GK）雄性大鼠40只，体质量309～412 g；Wistar 雄性大鼠10 只，体质量345～383 g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，合格证号：SCXK（沪）20070005。置于福建中医药大学实验动物中心饲养。

1.2 实验药物 丹瓜方药物组成：丹参15 g，瓜蒌15 g，薤白10 g，川芎10 g，赤芍10 g，郁金10 g，法半夏6 g，白僵蚕6 g，均购自福建中医药大学附属人民医院药剂科。盐酸二甲双胍片（上海信谊药厂有限公司，生产批号：091226B）；辛伐他汀片（广州南欣制药有限公司，生产批号：2117091）。

1.3 实验试剂 MCP-1 抗体（博士德生物工程有限公司）；NF-κB p65 抗体（美国CST 公司）；小鼠GAPDH 抗体（上海康成生物工程有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠（上海碧云天生物技术有限公司）；胰蛋白酶（美国BD 医疗器械有限公司）；破膜剂（美国Caltag 公司）。

1.4 实验仪器 培养板、低温高速离心机（美国Sigma-Aldrich 公司）；PVDF 膜（德国Millipore 公司）；ELX808 酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；Model 680 及电泳凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）；电泳仪和电泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模与分组 大鼠自由摄食饮水，适应性饲养2 周后，测量记录每只大鼠空腹状态下体质量，并检测所有大鼠的尾静脉随机血糖。非同一日内测2次每只GK 大鼠空腹血糖均≥11.1 mmol/L，40只成年雄性GK 大鼠均为糖尿病模型大鼠［4］。Wistar大鼠组随机血糖4.6～6.0 mmol/L。采用随机数字表法将GK 大鼠分为模型组、二甲双胍组、辛伐他汀组、丹瓜方组，每组10 只，Wistar 大鼠作为正常组。

2.2 药物干预 二甲双胍组按125 mg/（kg·d）予二甲双胍悬浊液灌胃，辛伐他汀组按1.7 mg/（kg·d）予辛伐他汀悬浊液灌胃，丹瓜方组按6.7 mg/（kg·d）予丹瓜方悬浊液灌胃，正常组与模型组予同体积无菌蒸馏水灌胃，各组每日9时灌胃，连续灌胃3个月。

2.3 Western blot 法检测大鼠视网膜组织MCP-1 和NF-κB p65 蛋白表达 各组干预3 个月后剪取大鼠视网膜组织至研钵中，加入液氮，快速研磨至粉末，经RIPA裂解液裂解，4 ℃、12 000 r/min下离心5 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度。配制分离胶、浓缩胶制成凝胶，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液后上样，进行凝胶电泳、转膜。转膜结束后，快速取出PVDF 膜，TBST 洗涤5 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。取出膜，于摇床上TBST 洗膜5 min×3 次。孵育袋中加入TBST 稀释的MCP-1（1∶400）、NF-κB p65（1∶1 000）和小鼠抗GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜5 min×3 次，加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔（1∶2 000）和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠（1∶2 000），室温孵育2 h。TBST 洗膜5 min×3 次，置于化学发光检测试剂（试剂A∶试剂B＝1∶1）反应2 min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF 膜，暗室中用X 胶片感光、显影、定影。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料符合正态分布以（xˉ±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

与正常组比较，模型组视网膜组织MCP-1、NF-κB p65 蛋白表达显著提高（P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组、辛伐他汀组和丹瓜方组MCP-1、NF-κB p65 蛋白表达均显著下降（P＜0.01），见表1、图1。

表1 5组视网膜组织MCP-1和NF-κB p65表达比较（xˉ±s）

图1 5 组大鼠视网膜组织MCP-1 和NF-κB p65 蛋白电泳图

3 讨 论

糖尿病性微血管病变是糖尿病的特异性并发症，常在糖尿病病程长和血糖控制不良的患者身上发现。消渴日久极易生痰、生瘀，痰瘀互结导致血行不畅，血脉瘀滞于眼底脉络，神光不能发越，故见视物模糊症状；另一方面，痰瘀阻滞脉络所致血行不畅、津液疏布失调，则消渴病变更甚。由此可见，消渴病与痰、瘀相互影响，痰、瘀会随着消渴病的发展而产生，而随着痰、瘀的加重，又会反过来使消渴病进一步发展，产生糖尿病微血管病变［9］。

丹瓜方由瓜蒌薤白半夏汤合新四物汤方化裁而来，方中丹参、川芎、赤芍、郁金等药物活血祛瘀，瓜蒌、法半夏、薤白、白僵蚕等药物化痰散结，活血祛瘀、化痰散结则血行通畅，津液输布正常，从而使病情得到控制。根据前期的临床研究，丹瓜方具有降低血糖、改善血液黏稠度的作用［10］，因此，重视“祛瘀化痰”法在治疗消渴内障方面具有重要的临床意义。

MCP-1 也称为趋化因子，来自趋化因子CC 亚家族，是最早发现和研究最广泛的CC 趋化因子。在糖尿病的病程中，因为长期血糖控制不佳、血糖偏高所形成的糖基化终末产物（AGEs）及糖尿病状态均可使MCP-1 表达显著增加，MCP-1 刺激炎症产生加重动脉硬化的形成。大量研究已经证明，MCP-1 具有调节动脉平滑肌细胞增殖和诱导视网膜新生血管的能力，故MCP-1 被认为是导致糖尿病血管并发症的一个危险因子［11-14］。NF-κB 是一个转录因子家族，可在疾病中控制多个细胞过程，包括炎症、增殖、血管生成等。NF-κB 可被糖尿病激活，随着NF-κB 的激活可使AGEs 的产生增加，并可使黏附分子的表达增加，使单核细胞与血管内皮细胞黏附，进而使血管硬化［15］。其中，由p65 亚单位形成的NF-κB p65 是目前研究发现的NF-κB 中作用最主要、分布最广泛的组合形式，它参与机体免疫和炎症反应，调节细胞凋亡、应激反应。KOWLURU 等［16］研 究发 现由Ras 相 关的C3 肉 毒素 底物1（Rac1）介导的视网膜中的NADPH 氧化酶2（Nox2）激活是糖尿病视网膜病变发病机制的早期事件，它导致线粒体损伤和毛细血管细胞凋亡的启动。Rac1启动子的结合位点之一是NF-κB，视网膜微血管系统中NF-κB 的p65 亚基与Rac1 启动子的结合增加，导致Rac1 激活Nox2，由此可见NF-κB p65 是糖尿病视网膜病变的发生的因素之一［16-17］。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组视网膜组织MCP-1、NF-κB p65 蛋白表达显著提高（P＜0.01），说明MCP-1 和NF-κB p65 可能是DR 的影响因子，MCP-1 和NF-κB p65 可能与DR 的发生、发展密切相关。与模型组比较，二甲双胍组、辛伐他汀组和丹瓜方组MCP-1、NF-κB p65 蛋白表达均显著下降（P＜0.01），提示丹瓜方能有效改善糖脂代谢及预防视网膜动脉硬化的作用。综上所述，丹瓜方可用于预防糖尿病患者并发DR，通过祛瘀化痰法治疗消渴内障方面具有重要的临床意义。