HPLC 法测定头孢氨苄中L- 头孢氨苄杂质的研究

王新辉

（华北制药股份有限公司倍达分厂，河北 石家庄 052165）

0 引言

头孢氨苄（Cefalexin） 为广谱类抗生素，可以抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，杀死细菌。为确保仿制药与原研药品质量和疗效一致，保证公众用药安全，中国开始推行一致性评价工作，要求仿制药厂家深入开展对药品的杂质及质量的研究工作。在《中华人民共和国药典》2020 版中头孢氨苄采用梯度测定有关物质，能有效分离7- 氨基去乙酰氧基头孢烷酸（杂质B 即7-ADCA） 和α- 苯甘氨酸（杂质A） 等杂质，但L- 头孢氨苄不能基线分离。故通过对流动相、梯度洗脱方法等进行优化，建立检测头孢氨苄中L-头孢氨苄的方法，并对该方法进行验证。

1 仪器和材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪。

电子天平。

pH 计。

1.2 材料

L- 头孢氨苄对照品，批号为2618-043A2。

头孢氨苄对照品，批号为1304008-201411。

氢氧化钠，AR 批号为20210107。

无水磷酸二氢钠，AR 批号为P1533702。

甲醇，HPLC 批号为21105212。

2 方法优化过程

经查阅各国药典，对比头孢氨苄有关物质所使用的方法，各国药典有关物质检查方法所用色谱柱的种类相同，均为C18 柱；中国药典和欧洲药典（英国药典） 所用流动相缓冲盐的pH 值、洗脱程序和检测波长相同，但缓冲盐的种类和浓度不同；与美国药典所用流动相、洗脱程序和检测波长均不同。对各国药典的有关物质检查方法进行对比优化，确定最佳检测方法。

2.1 方法选择

按照中国药典、欧洲药典（英国药典） 和美国药典的有关物质检查方法，分别配制供试品溶液和供试品溶液高温破坏溶液，分别进样，记录色谱图。美国药典方法的灵敏度低，不采用，中国药典和欧洲药典高温破坏溶液色谱图如图1 所示。

图1 中国药典和欧洲药典高温破坏溶液色谱图Fig.1 Chromatograms for high-temperature destruction solutions using Ch.P and EP method

由图1 可看出，中国药典方法主峰的分离度要优于欧洲药典方法，故在中国药典头孢氨苄有关物质的方法上进行优化对L- 头孢氨苄进行检验。

2.2 流速选择

在相同色谱柱、流动相和柱温条件下，分别设定流速为1.0 mL/min、1.2 mL/min 和1.5 mL/min，分别精密量取供试品高温破坏溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。比较不同流速下杂质的分离情况，不同流速下色谱图如图2 所示。

图2 不同流速下色谱图Fig.2 Chromatograms for Different flowvelocity

由图2 可看出，流速1.5 mL/min 下主峰与相邻杂质峰的分离度明显优于其他2 个流速，故方法选择流速为1.5 mL/min。

2.3 缓冲盐浓度选择

在相同色谱柱、流速和柱温条件下，分别配制0.05 mol/L、0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的磷酸二氢钠缓冲溶液（pH 值为5.0） 作为流动相A，比较系统适用性溶液的分离情况，不同浓度流动相A 系统适用性溶液色谱图对比如图3 所示。

图3 不同浓度流动相A系统适用性溶液色谱图对比Fig.3 Comparison of system suitability chromatograms for different concentrations of mobile phase A

由图3 可看出，缓冲盐浓度为0.05 mol/L 时系统适用性溶液中主峰与后临杂质峰间不能达到分离要求，浓度为0.1 mol/L 和0.2 mol/L 时，主峰与相邻杂质峰之间均能达到分离要求。故确定0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液（pH 值为5.0） 作为有关物质检测流动相A。

3 方法确定

3.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（4.6*150 mm，5μm），以0.1 mol/L 磷酸二氢钠（pH 5.0）为流动相A，以甲醇为流动相B，流速为1.5 mL/min，进样量为20μL，检测器波长为220 nm。梯度洗脱程序为：

B/%梯度洗脱时间/min 0153742555660 A/%989370703098982730307022

3.2 溶液的制备

3.2.1 流动相A

流动相A 0.1 mol/L 磷酸二氢钠（pH 值为5.0）溶液。以流动相A 作为空白溶液。

3.2.2 L- 头孢氨苄对照溶液

L- 头孢氨苄对照溶液精密称取L- 头孢氨苄对照品约2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，使用流动相A 稀释并定容。移取上述溶液0.02 mL，置于5 mL容量瓶中，加流动相A 稀释并定容。

3.2.3 混合定位溶液

混合定位溶液取EP 杂质A（α- 苯甘氨酸）对照品和杂质B（7-ADCA） 对照品各5 mg，分别置两个10 mL 容量瓶中，加流动相稀释并定容。称取头孢氨苄对照品5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用流动相稀释并定容。取上述各对照品溶液各1.0 mL，置于同一50 mL 容量瓶中，加流动相A 稀释并定容，作为有关物质混合定位溶液。

3.2.4 杂质混合定位溶液

杂质混合定位溶液精密称取L- 头孢氨苄对照品约2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，使用流动相A稀释并定容。移取上述溶液0.02 mL，置于5 mL 容量瓶中，加流动相A 稀释并定容。移取上述溶液0.1 mL 与“有关物质混合定位溶液”0.1 mL 混合，作为杂质混合定位溶液。

3.2.5 供试品溶液

供试品溶液取头孢氨苄供试品10 mg，置100 mL 容量瓶中，加流动相A 稀释并定容。

3.2.6 对照品溶液对照品溶液

精密量取供试品溶液1.0 mL 置于100 mL 容量瓶中，加流动相A 稀释并定容。

3.2.7 供试品溶液高温破坏

供试品溶液高温破坏取供试品溶液适量，在80 ℃水浴中加热60 min。

3.3 测定方法

测定方法按方法描述分别称取L- 头孢氨苄对照品溶液、对照品溶液和供试品溶液，并分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，含L- 头孢氨苄杂质的量不得过0.2%。

4 方法验证

4.1 专属性考察

取杂质混合定位溶液和流动相A（空白溶液）各10 μL，注入高效液相色谱仪，空白溶液在各目标峰处无明显干扰。杂质混合定位溶液中各目标峰的保留时间与加标供试品溶液中的保留时间一致，主峰与相邻杂质分离度分别为2.27、3.26。均满足专属性要求。空白溶液色谱图如图4 所示。

图4 空白溶液色谱图Fig.4 Chromatograms of blank solution

图5 L- 头孢氨苄定位图Fig.5 Chromatograms of Location map of L-Cefalexin

4.2 定量限/检测限考察

储备液：取L- 头孢氨苄对照品2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。转移上述溶液0.4 mL，置2 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。取头孢氨苄对照品2.5 mg，置于5 mL容量瓶中，用流动相A 稀释并定容，转移上述溶液0.4 mL，置2 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。取上述两溶液各0.3 mL，置同一10 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。

定量限溶液：取上述储备液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。

检测限溶液：取定量限溶液2.5 mL，置5 mL容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。

检测结果：L- 头孢氨苄信噪比S/N 为17.0 ～22.1，满足信噪比≥10∶1 的要求，定量限浓度为0.3180 μg/mL，相当于供试品的浓度百分比0.03%，连续进样6 针的RSD 为5.8%。

L- 头孢氨苄信噪比S/N 为7.5，满足信噪比≥3∶1 的要求，检测限浓度为0.1590 μg/mL，相当于供试品的浓度百分比0.02%，均满足要求。

4.3 线性范围

取定量限溶液0.4 mL，置于20 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。作为线性储备溶液。

分别取线性储备溶液0.5，1.0，1.5 和2.0 mL转移至10 mL 容量瓶中，并用流动相A 稀释定容。将定量限溶液及上述4 种溶液分别进高效液相色谱仪，记录色谱图。L- 头孢氨苄线性方程为：y=0.3022x- 0.0078，相关系数r 为0.9997。L- 头孢氨苄浓度范围：0.3180 ～2.1199 μg/mL，相当于供试品的浓度百分比0.03%～0.21%。

4.4 准确度

准确度储备液：取定量限溶液0.4 mL，置于20 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释并定容。

精密称取头孢氨苄供试品10 mg 9 份置于10 mL 容量瓶中，分为以下3 组：

（1） 分别移取1.0 mL 定量限储备液于容量瓶中，并用流动相A 稀释定容。

（2） 分别移取1.0 mL 准确度储备液于容量瓶中，并用流动相A 稀释定容。

（3） 分别移取1.5 mL 准确度储备液于容量瓶中，并用流动相A 稀释定容。

检验结果说明，LOQ 浓度水平加标供试品平均回收率为93%～117%（n=3），回收率的RSD 为14%（n=3），其余水平加标供试品溶液各水平的平均回收率均为113%～119%（n=3），回收率的RSD为2%～4%（n=3），符合要求。

4.5 重复性

精密称取头孢氨苄供试品10 mg 6 份置于10 mL 容量瓶中,并各转移1 mL 准确度储备液于该容量瓶中，分别进样，计算6 份样品中L- 头孢氨苄含量的RSD 值，为2%，符合重复性的要求。

5 结语

本文参考各国药典中头孢氨苄有关物质的测定方法，通过一系列的试验研究及对方法的优化，建立了梯度的方法对L- 头孢氨苄的杂质进行检测，并通过对方法的专属性、检测限、定量限、准确度等进行验证，结果表明，该方法灵敏度好、专属性强、准确度高，能有效分析头孢氨苄及其杂质L-头孢氨苄，为更好的控制头孢氨苄中的杂质提供了依据，可用于头孢氨苄中L- 头孢氨苄的检测和对头孢氨苄的质量控制。