广西新型鸭呼肠孤病毒流行毒株GX01-2020全基因组分子特征分析

谢守玉，刘惠心，周 媛，熊陈勇，施开创，屈素洁，苏文广，温新瑞，李 媛，李春英，邓桂潮，尹彦文*

(1.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001；2.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；3.北海市动物疫病预防控制中心，广西 北海 536000； 4.钦州市动物疫病预防控制中心，广西 钦州 535099；5.浦北县动物疫病预防控制中心，广西 钦州 535300)

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)宿主谱广泛，不仅能感染鸡、火鸡、鸭、鹅等家禽类[1-4]，而且可以感染野鸟[5]，给养殖业造成巨大经济损失。1950年，水禽源禽呼肠孤病毒(waterfowl-origin avian reovirus,WRV)在南非首次报道[6]。1972年，法国首次发现经典番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)[7]，随后，欧洲多个国家相继分离出MDRV毒株[8-10]。1997年，我国首次发现MDRV感染引发的疫情。MDRV主要感染3周龄内的雏番鸭，可持续带毒感染至6周龄，病死率为10%～30%[11]。2005年，我国东南沿海地区出现新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)引发临床上以肝脏不规则坏死及出血、脾脏严重肿大出血为特征的新发疫病，病死率为5%～50%，宿主谱比MDRV更为广泛，如番鸭、半番鸭、麻鸭、雏鹅等均能感染[12]。NDRV感染可导致患病鸭免疫器官萎缩或坏死，成为严重危害水禽养殖业健康发展的重要免疫抑制性疫病[13]。近年来，NDRV感染呈逐年上升趋势，已蔓延至全国养鸭主产地区，给水禽养殖业造成了重大经济损失。

NDRV为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，分片段的双股RNA病毒[14]。NDRV有10个RNA片段，大基因L1、L2、L3，分别编码λ A、λ B、λ C 蛋白；中基因M1、M2、M3，分别编码μ A、μ B、μ NS 蛋白；小基因S1、S2、S3和S4，分别编码P10、P18、σ C、σ A、σ B和σ NS 蛋白[15]。近年来，广东、福建、浙江、山东等地上传了NDRV全基因组序列，经序列分析发现国内的NDRV分离株亲缘性较近，但广西地区的NDRV相关报道很少，广西NDRV全基因组序列分子特征尚不明确。本研究从发病鸭的组织病料中鉴别诊断为NDRV阳性(命名为GX01-2020)，对其进行全基因组测序，并与国内外不同地区的NDRV、MDRV及CRV(chicken-origin avian reovirus)进行序列比对，分析GX01-2020全基因组的核苷酸序列及氨基酸序列，以期为广西地区NDRV的流行情况提供数据支持，为NDRV的有效防控和致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂MiniBEST viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0(批号：AK2501)，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批号：ASF0454A)，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0(批号：AK11054A)，pMD18-T载体(批号：ASF1711A)，DH5α感受态细胞(批号：AK71029A)均购于TaKaRa公司。

1.2 病料检测病料样品来自2020年广西北海某养鸭场发病的番鸭，采集肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等组织样品，放置含有适量PBS溶液(体积比4∶1，pH 7.2)的灭菌离心管中，经组织研磨仪磨至糜状，离心取上清用于总核酸提取，应用自主设计的特异性引物和TaqMan探针进行荧光定量RT-PCR检测。上游引物：5′-GGGTCGCACTACAGAGCAACT-3′,下游引物：5′-CGCCTCATCATAGTAATCTGCAA-3′,探针：CY5-CTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATG-BHQ3。反应体系为20 μL：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL，特异性上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，探针(20 μmol/L)0.2 μL，模板3 μL，灭菌双蒸水5.8 μL。反应程序：95℃ 20 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40个循环，同时收集荧光信号。结果判定：有扩增曲线，且Ct值小于35则判为阳性；无扩增曲线或Ct值大于35则判为阴性。

1.3 病毒全基因组扩增测序以检测结果为阳性的核酸为模板，应用本研究设计的NDRV全基因组测序引物(表1)，进行RT-PCR扩增。建立50 μL反应体系：模板2 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×One Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，无RNA酶灭菌水补足体系。反应程序：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环。反应结束后，PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 全基因组测序引物

PCR产物胶回收纯化后，连接至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆送至测序公司测序，每个片段重复测序3次。使用DNAStar软件包中的SeqMan对获得的基因片段进行序列拼接，最终得到GX01-2020全基因组序列。

1.4 NDRV全基因组序列分析将拼接后的10段核苷酸序列上传至NCBI的BLAST中进行比对，检验相似性最高的毒株。应用BioEdit软件对GX01-2020及国内外参考毒株(表2)基因组核苷酸序列及其氨基酸序列同源性进行分析。应用MEGA 7软件对比对后的序列进行最佳核苷酸替换模型计算：L1为GTR+G+I；L2，L3为GTR+G；M1为HKY+G+I；M2为K2+G+I；M3为GTR+I；σ A为K2+I；σ B，σ C为K2+G；σ NS为TN93+G+I。以最佳核苷酸替换模型为基础，采用最大似然法(maximum likelihood)绘制系统发育树，Bootstrap值定义为1 000次。应用RDP 4(recombination detection program 4)和SimPlot(ver 3.5.1)软件进行全基因组的重组分析，检测是否有重组。

表2 NDRV主要参考毒株信息

2 结果

2.1 全基因组测序结果应用SeqMan软件将测序得到的片段进行拼接，结果显示，GX01-2020株全长为23 353 bp，共有10个基因组片段：L1(3 958 bp)，L2(3 830 bp)，L3(3 900 bp)，M1(2 284 bp)，M2(2 134 bp)，M3(1 996 bp)，S1(1 568 bp)，S2(1 290 bp)，S3(1 202 bp)，S4(1 191 bp)。应用NCBI上的ORF预测结果显示，有9个片段只编码单个ORF，编码的氨基酸大小为97～1 293 aa，而S1编码3个相互有重叠区域的ORF，分别为p10(20～313 bp)、p18(273～761 bp)及σ C(571～1 536 bp)(表3)。

表3 GX01-2020株基因组结构特征

2.2 全基因组核苷酸及氨基酸同源性分析应用BioEdit软件将广西GX01-2020株与国内外参考毒株全基因组核苷酸序列进行比对发现，10个片段的基因组序列与参考毒株的核苷酸序列同源性为42.1%～99.4%(表4)。其中，λ系列蛋白核苷酸序列与参考毒株的同源性为42.1%～98.6%，氨基酸序列同源性为15.5%～99.9%，核苷酸同源性最高的分别为广东SH12株(98.0%)、广西GX-Y7株(98.6%)及重庆SL株(98.2%)，氨基酸同源性最高的分别为广东SH12株(99.9%)、河南HN5d株(99.7%)及山东DE150株(99.6%)。μ系列蛋白核苷酸序列与参考毒株的同源性为63.5%～98.7%，氨基酸序列同源性为77.2%～99.4%，核苷酸及氨基酸同源性最高的均为重庆SL株，同源性分别为97.7%和99.0%,98.4%和99.4%,98.7%和98.7%。σ系列蛋白核苷酸序列与参考毒株的同源性为21.2%～99.4%，氨基酸序列同源性为23.5%～99.7%，核苷酸及氨基酸同源性最高的分别为北京J18株(98.4%和99.7%)、广西GX-Y7株(99.4%和99.7%)、广东SH12株(97.9%和97.8%)及重庆SL株(99.3%和99.4%)。

2.3 遗传进化分析对GX01-2020株及参考毒株的10个全基因组片段进行系统发育分析(图1)，结果显示，10个片段的核苷酸遗传进化树基本相似，以GX01-2020、广西GX-Y7株与国内外的NDRV代表毒株为一个进化分支，以经典MDRV和CRV为另外两个独立的进化分支。但也有不同，如L2、L3的进化树中，MDRV代表毒株组成两个不同方向的进化分支；σ A的进化树中NDRV分成两个进化分支，其中上海TH11株、福建NP03株及山东SD-12株与国内的MDRV参考毒株组成一个分支，而GX01-2020株、广西GX-Y7株及其他NDRV参考毒株与法国MDRV毒株组成另一个分支。此外，遗传距离也有不同。M2片段进化树中，NDRV与CRV遗传关系较近，而其他片段进化树中NDRV则与MDRV较近；σ A系统发育树中，上海TH11株、福建NP03株及山东SD-12株与国内的MDRV参考株遗传关系较近，而GX01-2020株、广西GX-Y7株等其他NDRV毒株与法国2个MDRV毒株关系较近。

2.4 重组分析应用RDP4和SimPlot软件对GX01-2020株的10个基因组片段与参考毒株的基因组核苷酸序列进行重组分析。结果，SimPlot软件检测到GX01-2020株的L1片段存在重组信号，重组亲本为北京J18株和福建NP03株(图2A)。RDP4软件检测到北京J18株的L1片段和广东SH12株的L2片段有重组信号，重组亲本分别为广东SH12株与福建NP03株，山东SD-12株与广东DH13株，但SimPlot未检测出重组的具体位点。此外，浙江ZJ2000M株的S1片段在RDP4和SimPlot中均有重组信号，重组亲本为北京815-12株与法国D1546株(图2B)。

A.GX01-2020,MDRV_J18和DRV_NP03/CHN/2009的L1片段重组分析;B.MDRV_ZJ2000M,MDRV_815-12和MDRV_D1546的S1片段重组分析

3 讨论

广西属于亚热带气候边境地区，为野鸟迁徙过冬常驻区域，加强边境地区水禽源ARV流行病学调查及分子流行病学研究至关重要。本研究采集的病料源自广西北海的番鸭养殖场，解剖发现典型的病理变化为肝脏肿大坏死、脾脏严重肿大充血，呈“樱桃”状。通过自主设计的特异性引物及探针进行实验室分子诊断，检测结果为NDRV阳性，而经典MDRV、AIV、NDV、DTMUV、MDPV、GPV等病原核酸检测结果均为阴性。经全基因组序列测序发现，GX01-2020株共有10个基因组片段：L1～L3、M1～M3、S1～S4。基因组核苷酸序列分析显示，除S1片段外，其他基因组片段大小同WRV和CRV相似。ORF预测表明GX01-2020株除S1外的片段为单顺反子结构，只编码单个ORF，而S1片段为多顺反子结构，编码3个部分重叠区域的ORF。这与CRV类似，但与WRV不同[16-18]。表明，GX01-2020株为不同于MDRV的NDRV。

核苷酸序列同源性分析结果显示，L级片段中λ A核苷酸序列同源性最高的为广东SH12株，该毒株为ZHANG等[19]2012年从广东省的雏番鸭组织中分离到的NDRV毒株；λ B核苷酸序列同源性最高的是广西GX-Y7株，这是基因库上来源广西地区NDRV毒株；λ C核苷酸同源性最高的为重庆SL株。表明，L基因组片段不完全具有地域遗传特征。本研究中GX01-2020株L组片段核苷酸序列与NDRV代表株的同源性均在92.5%以上，这与部分学者研究结果一致[20-22]。此外，发现GX01-2020株L组片段核苷酸及氨基酸序列同源性最低的均为CRV(法国2株MDRV除外)，推测可能的原因是该组片段序列来源于CRV几率较低，主要来源于WRV的重排。M级基因组片段核苷酸同源性最高的均为重庆SL株，为98%左右。此外，μ B核苷酸及氨基酸序列同源性最低的毒株均为经典MDRV，而μ A、μ NS片段的则是CRV，这从遗传进化树上也能得出相似结论。表明，M级基因组序列的来源祖先不同。S级片段编码的σ系列蛋白中，σ A核苷酸同源性最低的为MW9710株(21.2%)，这是1997年从福建的番鸭分离到的MDRV，由于该片段不完整，仅有300 bp，故导致同源性低于CRV毒株。σ C蛋白在病毒感染早期阶段起关键作用，调节病毒粒子与宿主细胞间相互作用及诱导产生特异性中和抗体[23-24]。此外，对σ C蛋白的核苷酸序列比对分析，通常是作为ARV毒株鉴定与分类的遗传标签[25-28]。本研究中，GX01-2020株σ C核苷酸序列与NDRV代表株同源性为89.1%～97.9%，远高于MDRV的41.5%～43.0%和CRV的36.2%～39.2%，再次印证GX01-2020株为NDRV毒株。另外，通过核苷酸及氨基酸序列同源性分析发现，同源性最低的毒株均为CRV，表明σ级序列来源WRV的几率要大于CRV。以上结果表明，GX01-2020株全基因序列与NDRV流行毒株有高度的同源性，具有遗传多样性的分子特征。

本研究的系统发育分析结果中，基于10个全基因组片段核苷酸序列的遗传进化树基本按ARV种类分化，即NDRV、经典MDRV与CRV组成3个不同的进化分支。但L2、L3、σ A的进化树中，MDRV的代表毒株形成2个独立的进化分支，而其他片段的进化树中MDRV参考毒株组成一个独立的进化分支。其中，来自法国的MDRV毒株D1546和D2044组成一个分支，来自国内的MDRV毒株组成另一个分支。这与GX01-2020株核苷酸同源性分析结果一致，L2、L3片段与法国MDRV毒株同源性显著低于其他MDRV代表毒株。此外，σ A进化树中，NDRV毒株分成2个进化分支，一支是由TH11、NP03、SD-12与MDRV毒株ZJ2000M、815-12、MW9710组成；另一支是GX01-2020、GX-Y7等NDRV毒株与法国MDRV毒株组成，这与σ A同源性分析结果相符合。另外，在遗传距离方面，NDRV的M2片段与CRV较近，与MDRV较远，这与其他片段不同，表明核苷酸序列来源祖先可能不同。以上结果与其他学者研究结论相似[19,29-31]。最后，CRV参考毒株来源地有加拿大、美国、匈牙利、韩国和中国，10个片段系统发育树中，CRV毒株均在同一个进化分支，表明不同地域的毒株并未呈现不同的进化趋势，参考毒株没有明显的地域性遗传特征。

重组分析发现GX01-2020株与北京J18株的L1片段检测到重组信号，这与WANG 等[30]研究结果一致。ZHANG等[19]研究发现J18株的M2片段，广东SH12株及DH13株的S2片段均存在重组现象，但本研究并未检测到该片段的重组信号。此外，本研究中广东SH12株的L2片段和浙江ZJ2000M株的S1片段均检测到重组信号，其亲本毒株均为同种属的病毒，但ZHANG等[19]并未有相关报道。表明，目前重组只发生在NDRV之间及MDRV内部，并未发现NDRV、MDRV与CRV毒株相互之间有重组现象。但随着病毒自身的不断演化，宿主免疫系统的压力及外部环境因素的影响等综合因素作用下，这种情况也许会发生。因此，需密切关注ARV，尤其是对新型NDRV的分子流行病学研究将为该病毒引发疫病的有效防控奠定基础。