基于多酸材料的过氧化物模拟酶的研究及应用进展

杨 爽,何承运, 游文武, 李艳周*

(1. 河南大学 化学化工学院, 河南省多酸化学重点实验室, 河南 开封475004; 2. 河南大学 物理与电子学院, 河南 开封 475004)

酶(包括少量核酸和蛋白质分子)是一种催化和维持生命体内各种化学反应有序进行的重要物质[1-2]。其具有底物特异识别性、催化效率高、酶催化种类繁多等优点。但其从动物组织提取和微生物发酵中分离纯化难、提取出来后易失活难储存、使用条件严格(需合适的温度和酸碱度)等不足极大的限制了其在生产实践中的应用[3]。所以，通过化学合成的方式来设计模拟具有生物酶活性的材料，逐渐成为解决生物酶缺陷的有力策略。

迄今为止，已发现许多材料具有显著的酶催化活性，包括金属纳米粒子、碳基材料、复合材料、金属氧化物材料等[4-7]。多金属氧酸盐(POMs)作为一种由氧和V族和VI族最高氧化态的金属(W、Mo、V等)组成的金属氧簇基金属氧化物，在生物医学领域有着广泛的应用前景[8-15]。与其他金属氧化物材料相比，POMs中与氧原子配位的主要金属离子通常不暴露在外部环境中，导致POMs产生离域负电荷。因此，POMs一般是具有明确结构的聚阴离子。POMs的一个优点是其具有氧化还原性质以及酸碱反应性；它的另一个优点是它们在原子或分子水平上易于调节，即可以通过从母体中去除一个、两个或三个金属八面体从而形成单、双或三缺位POM前驱体构筑块[15]。所以POMs不仅可以形成本身具有纳米尺寸的饱和聚阴离子，如H3PW12O40、H4SiW12O40和H3PMo12O40，也可以将形成的缺位构筑块与金属离子发生配位反应形成金属取代的POMs等。对POMs结构的设计合成与性能研究一直都是金属氧簇领域的一个经久不衰的研究热点[8, 10]。

科学家发现POMs材料还具有许多在生物和医学领域可以应用的理想特性，如低毒、生物稳定性、结构多功能性、优越的氧化还原活性等。因此，POMs材料已被广泛应用于抗肿瘤和抗病毒研究中[9]。POM在不改变其结构及组成的同时可以发生迅速的多电子氧化还原过程，使其成为优异的氧化还原传感材料。据报道，POMs可以通过多步骤电子转移过程催化O2和H2O2实现对有机底物的环氧化和氧化[16]。因此，POMs也具有氧化一些染料如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)使其发生颜色改变的类过氧化酶活性。目前提升POMs材料类过氧化酶活性的途径主要分为以下两类：一是利用POMs材料的结构多样性改变其功能构筑块；二将POMs与其它纳米材料制备成复合材料(如与碳纳米管、石墨烯复合)[17-33]。

过氧化氢是一种广泛存在于食品、药品、生物体、工业生产和环境污染中的化学品，准确、快速地测定过氧化氢具有重要意义[34-37]。POMs分子团簇的尺寸小，比表面积大，活性位点多，因而在基于类过氧化物酶催化反应的生物检测中可以实现更快的反应动力学(更短的检测时间)以及更低的检测极限[38]。目前已经有很多关于纳米酶的优秀综述报道[39-41]，但是到目前为止，集中于POMs及其复合材料作为类过氧化物酶的报道还很少。此外，将POMs及其复合材料作为类过氧化氢酶的详细分类也很少受到关注。本文按照材料结构类型进行了分类，总结了近期关于POMs及其复合材料在类过氧化氢酶催化方面的研究进展(如图1所示)，并对POMs作为类酶所面临的挑战和未来的发展方向进行了总结和讨论，以期引起来自不同学科的研究人员，包括化学、生物学、材料科学和生物化学等领域的研究人员的关注。

图1 多酸材料作为类过氧化酶催化氧化TMB的示意图Fig.1 Schematic diagram of TMB catalyzed by typical polyoxometalate materials as peroxidase-like enzyme

1多酸基材料作为类酶的研究进展

1.1 饱和Keggin型多酸材料

Keggin型POMs是目前合成最多的杂多金属氧簇，也是目前研究最为充分的一类金属氧簇化合物。该结构类型的化合物是由Keggin在1934年通过计算H3PW12O40的X射线粉末衍射谱得到，其最终结构的确定是在1936年[16]。Keggin型结构阴离子的通式可表示为[XM12O40]n-(X=P、Si、Ge等；M=Mo、W等)。该结构类型的阴离子是由12个八面体和一个中心原子四面体组成；每3个八面体通过共边连接成为一个三金属簇，4组三金属簇再通过共顶点形成分子笼簇，中心杂原子在分子笼簇中心，整个阴离子呈现出Td对称性，其直径通常为1～5 nm。值得一提的是，该Keggin型POMs的阴离子在水溶液体系中具有非常好的稳定性，这为其作为类酶催化剂提供了有力保证(如图 2所示)。

图2 饱和Keggin型多酸作为类过氧化氢酶的示意图Fig.2 Schematic diagram of saturated Keggin-type POM as peroxidase mimic enzyme

东北师范大学王晓红教授课题组首次证明三例饱和Keggin型聚多金属酸盐(H3PW12O40、H4SiW12O40和H3PMo12O40)具有过氧化物酶催化活性[17]，可以催化过氧化物酶底物TMB在水溶液中形成蓝色。其中，H3PW12O40对TMB的催化活性高于天然酶HRP和其它两种POMs。他们还基于POMs/H2O2/TMB体系构建了一种简单、准确的过氧化氢或葡萄糖比色检测的方法。其对过氧化氢和葡萄糖检测都具有良好的响应，线性范围分别为0.134～67 μmol·L-1和0.1～100 μmol·L-1。随后，其他Keggin型阴离子也被报道具有较好的的类酶催化活性[18]。2019年，吉林大学齐燕飞教授课题组研究了18种具有不同结构的经典POMs的类酶活性[18]，其中包括饱和Keggin的H3PW12O40、H4SiW12O40、H4GeW12O40、K4GeW12O40、H3PMo12O40、 H4SiMo12O40等。他们发现POMs的结构、杂原子、配位原子、取代金属离子、pH和底物种类都是影响类酶活性的因素。在其所研究的18种POMs中，H3PW12O40、H4SiW12O40和H4GeW12O40具有类过氧化酶活性，而H3PMo12O40和H4SiMo12O40展现出来的是氧化酶活性，K4GeW12O40既没有显示过氧化酶活性也没有氧化酶活性。换言之，饱和Keggin的多钼酸盐具有氧化酶活性，而饱和Keggin的多钨酸盐具有过氧化酶活性。对于饱和Keggin型POMs而言，pH在2.5～5之间展现出优异的类酶活性，但是pH在大于6时其活性逐渐降低。该项系统的研究不仅为POMs作为类酶提供了详尽的背景资料，也为设计具有类酶活性的POMs提供了指导。除了有关游离饱和Keggin型POMs的研究，近年来，科学家还将饱和Keggin构建单元引入到金属有机框架(MOF)中，得到多例新颖的结合了POM化学优点与MOF化学特性的具有过氧化物酶样活性的材料[19]。因为将Keggin型POMs嵌入到MOFs的有序通道中，不仅可以在空腔内提供更多的跳跃位点，也有助于提高MOFs的稳定性。另外，POMs阴离子通常在晶态下通过较强的氢键亲和力，被大量的水分子包围，这可能会构建离子或电子的传输途径。POMs与MOFs的协同作用可能会使其展现出更加优异的过氧化物酶活性。例如，苏忠民课题组在水热条件下制备了由Keggin型POMs支撑的稳定的金属有机框架Cu6(trz)10(H2O)4[H2SiW12O40]·8H2O (trz=1,2,4-三唑) (如图3a所示)[20]。该材料由Cu2+离子形成了具有22元环的二维层状结构，它们通过ab平面上的trz配体相互连接。此外，二维层通过Keggin型POM阴离子进一步相互连接，生成一个具有一维通道的三维多孔网络。POM阴离子的存在不仅使其表现出对水的选择性吸附和质子导电性能，也显示出有效的内在过氧化物酶样活性。

另外，曲阜师范大学沙靖全课题组合成了一种新型的POM模板3-D铜(II)-三唑框架[(Cu10(trz)10(OH)6(Cl)4][H3PW12O40]·2H2O[21](如图 3b所示)。单晶X射线衍射表征结果显示该三维POM/铜(II)-三唑杂交框架材料具有一维通道，且在块状Keggin型磷酸钨态模板下具有pcu拓扑结构。该新型化合物可以作为一种新型的过氧化物酶，在H2O2存在下可有效催化TMB的氧化。该课题组发现TMB、trz和磷酸钨酸之间的静电相互作用和氢键/π-π堆叠相互作用是增强过氧化物酶样活性的原因。此外，该组还探讨了所得材料在H2O2的比色传感方面的应用并展现出较宽的线性范围(1～80 μmol·L-1)、低检测限(0.21 μmol·L-1)以及快的响应速度 (2 min)。同年，王佳宁课题组也采用trz与Cu的同族金属Ag反应，得到一种稳定的三明治型POM柱状配位聚合物[Ag15(trz)10][SiW12O40](Ag15SiW12)[22](如图 3c所示)。单晶X射线衍射(SCXRD)分析表明，SiW12聚阴离子夹在相邻的具有两种不同孔隙的Ag-trz片之间，形成了一个三维的POM柱片状框架。该课题组研究了Ag15SiW12的过氧化物酶活性，结果显示其也具有广泛的线性范围 (1～100 μmol·L-1)、更快的响应时间(1 min)和更低的检测极限(0.27 μmol·L-1)。他们将Ag15SiW12优异的过氧化物酶活性归因于该材料独特的结构和各个组分间的协同作用。

图3 基于饱和Keggin型POM的金属有机框架Cu6(trz)10(H2O)4[H2SiW12O40] (a)， [(Cu10(trz)10(OH)6(Cl)4][H3PW12O40] (b)和[Ag15(trz)10][SiW12O40](Ag15SiW12) (c)的结构Fig.3 Structures of Cu6(trz)10(H2O)4[H2SiW12O40] (a), [(Cu10(trz)10(OH)6(Cl)4][H3PW12O40] (b) and [Ag15(trz)10][SiW12O40](Ag15SiW12) (c)

1.2 过渡金属取代多钨酸材料

过渡金属取代的POMs在过去的二十年里一直吸引了人们的兴趣，它们不仅拥有迷人的结构拓扑，而且在催化、纳米科学、磁性、发光和电化学材料方面有很大潜在应用。一般来说，Zr(IV)离子具有高氧化态(+4)和可变的配位模式，其配位键长度约在0.20～0.25 nm之间不等。此外，Zr(IV)离子具有较强的嗜氧性，对结合无机和有机氧供体配体具有较高的配位能力，这为各种有机官能团修饰的Zr(IV)取代的POM基分子材料的设计合成和功能化提供了可能[23]。2012年，李阳光教授课题组报道了三例新的含有四核{Zr4}取代的多钨酸盐，证实了Zr取代的POMs对O供体配体具有显著的亲和力[24]。该课题组将过氧化氢、D，L-曼德尔酸和醋酸缓冲液引入含有Zr(IV)离子和各种三缺位的多钨酸盐前驱体的反应体系中，得到了一系列新的锆取代的多钨酸盐Na4(NH4)14[Zr4(μ3-O)2(μ-O2)2(OAc)2(P2W16O59)2]·51H2O (1) (如图4a所示) 和 (NH4)16[Zr4(μ3-O)2(Mal)2(H2O)2(P2W16O59)2]·14H2O (2) (如图4b所示)。化合物1和2具有类似的三明治型结构，这些结构由四核Zr簇和两个[P2W16O59]12-构建，但它们在{Zr4}簇上的修饰配体不同，1和2的修饰配体分别是醋酸和D，L-曼德尔酸。这三例材料中，化合物1表现出最好的催化活性，其双氧水的线性检测范围为100～1 000 μmol·L-1(R2= 0.997)，检测限为100 μmol·L-1。通过对比空白实验发现具有过氧化物酶活性的四核Zr取代的多钨酸盐的催化性能主要归因于夹心{Zr4}簇的独特结构特征，而不是缺位的多金属氧酸盐阴离子本身或独立的Zr离子。换而言之，该研究结果表明，有机-无机杂化材料的性能优异性可能是由于单个组分的特定性质和相应的协同效应的结合而引起的。2015年高广刚课题组也发现了类似的协同作用，该课题组报道了两种基于铜(II)-咪唑络合物改性夹心型钨铋酸盐或钨锑酸盐，Na4H2[Cu4(H4im)12(H3im)2][Cu3(H2O)3(XW9O33)2]·nH2O (H4im=咪唑，H3im=去质子化咪唑、X=Bi(1)、n=28或X=Sb(2)、n=25) (如图 4c所示)[25]。夹心型的聚氧阴离子[(Cu3(H2O)3(XW9O33)2]12-被两个铜(II)-咪唑配合物修饰形成1或2。与其他Keggin型多酸基类过氧化物酶相比，1和2使用TMB作为过氧化物酶底物在生理pH附近均表现出良好的过氧化物酶活性。其对双氧水得检测线性范围在1～50 μmol·L-1间，检测限为0.12 μmol·L-1。三明治型多钨氧簇和铜(II)-咪唑配体物的协同效应可能是增强过氧化物酶样活性的主要原因，这是因为咪唑配体与带负电荷的多钨氧簇相互作用增加了对TMB底物的亲和力。

图4 过渡金属取代的多钨酸盐阴离子 [Zr4(μ3-O)2(μ-O2)2(OAc)2 (P2W16O59)2]18- (a)、[Zr4(μ3-O)2(Mal)2(H2O)2(P2W16O59)2]16- (b)和[Cu4(H4im)12(H3im)2][Cu3(H2 O)3(XW9O33)2]6- (c)的结构Fig.4 Structures of transition metal substituted polytungstate anions [Zr4(μ3-O)2(μ-O2)2(OAc)2 (P2W16O59)2]18- (a), [Zr4(μ3-O)2(Mal)2(H2O)2(P2W16O59)2]16- (b) and [Cu4(H4im)12(H3im)2][Cu3(H2 O)3(XW9O33)2]6- (c)

除了双氧水，过渡金属取代的多钨酸盐还可以作为级联反应中的一环用于多巴胺(DA)和莱克多巴胺(RAC)的比色检测。时君友课题组建立了一种基于SiW9M3(M=Co2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+)过氧化物酶活性的比色检测方法[26]。其对DA的检测限低至5.38 μmol·L-1，而对RAC的检测限为79.4 μmol·L-1。除了以Si为杂原子中心的多酸，王晓红教授课题组还报道了一系列过渡金属取代的磷钨酸盐，并研究了过渡金属取代多氧金属酸盐PW11MO39n-和PW9M3O34n-，(缩写为PW11M和PW9M3，其中M=Cu2+、Co2+、Mn2+、Fe3+)在TMB氧化过程中的类过氧化物酶活性[27]。在上述材料中，PW11Cu和PW9Cu3由于具有较高的氧化还原电位，因此其活性最高。PW11Cu的双氧水检测线性范围为8.96×10-2～2.2 μmol·L-1，检测限为0.006 μmol·L-1；PW9Cu3的双氧水检测线性范围为1.21×10-2～1.21 μmol·L-1，检测限为9.8×10-4μmol·L-1。此外，王晓红课题组还发现在反应体系中加入三聚氰胺可以进一步地提高PW11Co(Cu)与三聚氰胺的相互作用，产生更多的羟基自由基，从而提高PW11Co(Cu)类过氧化物酶的活性。

1.3 多钼酸盐多酸材料

通过前文叙述，基于饱和Keggin型的多酸材料(H3PW12O40、H4SiW12O40等)和过渡金属取代的多酸材料(SiW9M3、PW11M等)都表现出较好的过氧化氢酶样活性[16,26-27]。这些研究主要集中于含钨的POMs(W-POMs)，但对于含钼POMs(Mo-POMs)的研究和报道却是很少。与W-POMs相比，Mo-POMs比具有相同结构的W-POMs具有更强的氧化能力(Mo > W)[39]，因此可以作为更优异的纳米酶，这意味着 Mo-POMs可能会表现出新颖的类酶催化性能。例如，东北师范大学李阳教授课题组发现一种钒钼磷杂多酸(H5PMo10V2O40，PMoV2)，具有过氧化物酶样活性，可以催化鲁米诺/H2O2反应产生化学发光(CL)[28]。在此基础上，该课题组设计了一种无酶鲁米诺/H2O2/PMoV2的CL系统，用于过氧化氢的超灵敏检测。CL强度在高达5×106μmol·L-1的宽范围内与H2O2浓度表现出良好的线性相关性，其双氧水检测限为5 000 μmol·L-1，除了双氧水的检测之外，该方法也成功地用于人血清中葡萄糖的测定。该研究为功能性多酸材料在多种生物传感分析(如胆固醇、尿酸、乳酸等的测定)中的应用提供了可能性[31,35]。除了PMoV2，王晓红教授课题组也设计报道了一种叶酸功能化多金属钼酸盐(FA-PMo4V8)，可在无需使用过氧化物酶和肌氨酸氧化酶(SOD)的条件下，利用TMB比色反应中检测H2O2和肌氨酸[29]。在最佳条件下，FA-PMo4V8表现出优异的过氧化物酶样活性，检测线性范围为0.007～4 μmol·L-1，检测限为0.012 μmol·L-1。此外，该课题组还发现FA-PMo4V8通过在氧气存在下与肌氨酸反应可以生成 H2O2，因而可以间接实现肌氨酸的检测，其具体检测的线性范围为0.2～500 μmol·L-1，检测限为0.311 μmol·L-1。由于FA-PMo4V8易于制备，可工作pH范围大，其在检测中具有良好的选择性、重现性和高的灵敏度，因而在对尿肌氨酸的比色检测中具有较大的优势，有望用于临床试验。

除钼钒酸盐以外，沙靖全课题组报道一例含Fe3+和Mo6+的Anderson型多酸(NH4)3(H6Fe(III)Mo6O24](FeMo6)[30]。该材料首次作为一种类氧化酶模拟酶，表现出催化氧化邻苯二胺(OPD)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTs) 和TMB的能力。由于FeMo6具有类芬顿效应，该课题组开发了一种两次连续“开启”荧光的新型传感器。并用该传感器使用FeMo6-OPD系统实现了多巴胺的检测，线性范围为1～100 μmol·L-1，检测限为2.27×10-2μmol·L-1(3σ/s)。

2 多酸基复合材料作为类酶的研究进展

2.1 多酸与石墨烯复合材料

氧化石墨烯(GO)是石墨烯的氧化物，经氧化后，其含氧官能团增多而使得其化学性质较石墨烯更加活泼，从而扩宽了其应用范围。例如，2010年，曲晓刚研究小组发现在H2O2存在下，羧基(-COOH)功能化的氧化石墨烯(GO)具有类过氧化氢酶活性，可以催化TMB产生蓝色产物[40]。此外，GO具有优异的机械性能，坚固耐用，表面积大，可作为载体锚定各种不同的材料[41-43]。2015年，哈尔滨工业大学胡平安教授和邱云峰副教授课题组合成了二苯丙氨酸(FF)肽阳离子、PW12和GO的复合材料[44](如图5所示)。复合材料的优势如下：1) 由于非共价相互作用，FF的引入可增强复合材料的生物相容性和对TMB的亲和力；2) FF和POMs之间的强静电相互作用可以增强异相材料的稳定性；3) GO作为载体的引入可以最大化的优化FF/POMs复合材料的分散和整个复合材料的比表面积，并由于芳香区域和/或GO基面上丰富的含氧基团的相互作用能力而增强TMB或H2O2的亲和力；4) GO和POMs之间的强电子转移会改变 POMs的氧化还原性能。实验结果表明，二肽-多金属氧酸盐(POMs)-氧化石墨烯(GO)三元杂化物是一种极好的过氧化物酶样模拟物[42]，与单独的POMs相比，过氧化物酶活性得到了增强。使用TMB作为显色底物，FF@PW12的类过氧化物酶活性比原始PW12在均相中的活性高13倍。此外，含有5% GO的FF@PW12@GO三元杂化物的类过氧化物酶活性是FF@PW12的1.7倍。

图5 FF@PW12/GO类过氧化物酶催化过程示意图(a)及其复合材料的纳米形貌(b、c、d和e)[44]Fig.5 Schematic diagram of the catalytic process (a) and the nanomorphology of FF@PW12/GO peroxidase-like enzyme (b, c, d and e)[44]

2.2 多酸与单壁碳纳米管复合材料

图6 基于PMNT-2类酶催化L-Crys变色生物响应机理示意图(a)和材料的形貌表征结果(b、c和d)[46]Fig.6 Proposed mechanistic scheme for the L-Cys colorimetric biosensing on PMNT-2 (a) and its morphology characterized by SEM, TEM, and EDX elemental mapping (b, c and d)[46]

2.3 多酸与聚吡咯复合材料

除了导电性能良好的石墨烯和单壁碳纳米管材料外，导电高分子材料—聚吡咯(PPy)也是一种典型的具有超高比表面积的导电聚合物[47]。研究发现，PPy可以作为一种提供电子快速传输的“桥”，从而可以提高复合材料的催化性能[48-49]。2019年，沙靖全课题组利用PPy涂层包裹四重螺旋Ag5[bimt]2[PMo12O40]·2H2O(Ag5PMo12)作为一种过氧化物酶模拟物用于尿酸的选择性比色检测，尿酸检测的线性检测范围为1～50 μmol·L-1，检测限为0.47 μmol·L-1(如图7所示)[50]。2020年，该课题组还通过简便的原位氧化聚合工艺在另外一种具有八重螺旋的新型Wells-Dawson型多酸基金属有机框架 [Cu9(FKZ)12(H2O)8][H3P2W18O62]2·4H2O (CuFK ZP2W18) (HFKZ=1-(2,4-二氟苯基)-1,1-双[(1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基])中引入PPy，制备获得CuFKZP2W18/PPy(n)纳米复合材料(n= 7%、15%、30%)[51]。其中CuFKZP2W18/PPy(15%)表现出优异的类过氧化物酶催化活性。在以TMB为底物的比色法监测中表现出较低的检测限(对H2O2为0.07 μmol·L-1，对抗坏血酸为0.627 μmol·L-1)，较小的Km值(对H2O2为106 μmol·L-1，对邻苯二胺为42 μmol·L-1)以及高的灵敏度(对H2O2为2.271×10-2μmol·L-1，对抗坏血酸为2.51×10-3μmol·L-1)。

图7 Ag5PMo12 (a), PPy (b), 和 Ag5PMo12@PPy的形貌表征(c)及Ag5PMo12@PPy材料(d)的元素成像图； H2O2 + TMB + Ag5PMo12@PPy反应体系的吸收光谱(e)和(g)和对应的反应过程(f)[50]Fig.7 SEM of Ag5PMo12 (a), PPy (b), and Ag5PMo12@PPy (c), and corresponding EDX elemental mapping images of Ag5PMo12@PPy (d); Absorption spectra (e and g) of the H2O2 + TMB + Ag5PMo12@PPy system and the corresponding process (f)[50]

3 结论与展望

我们以POM材料结构类型为分类标准，系统介绍了POM材料在类过氧化物酶领域的最新研究进展。尽管POM类酶克服了生物酶的许多缺点，但其仍然存在一些挑战。

1)目前POM模拟酶的研究主要集中在少数POM中(如表1所示)，然而目前已有成千上万种具有不同结构特色的POM被报道，如何高效地筛选性能优异的POM模拟酶是一个具有很大地挑战性。

表1 一些典型的POM基类过氧化物酶

2)特异性是生物酶的基本特征之一，但是对于POM类酶而言，它们并不具备特异性，可以氧化还原一类底物。所以，特异性的缺乏也是目前制约POM类酶走向实际生产应用的主要问题之一。进一步在POM类酶材料表面进行抗体或者适配体修饰有可能赋予其特异性。

3)POM作为类酶，其大小，形态，表面状态等性质与其酶催化性能之间的相互关系仍旧研究甚少。POM比表面积越大，催化活性越高，但是目前作为类过氧化物酶的非水溶性的POM大多为块体单晶结构，纳米级的POM制备可能是进一步提高酶催化活性的有效手段；但是过多的增加POM类酶的比表面积，又会降低纳米POM材料的稳定性。所以POM类酶的纳米化及其稳定性问题也是值得研究的问题。