lncRNA DGCR5通过靶向调控miR-21抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移

籍玉青 尹永波 邱金霞

(邢台市人民医院 1耳鼻咽喉科，河北 邢台 054001；2放射科)

鼻咽癌是东南亚和华南地区最常见的头颈部肿瘤，放疗是其有效治疗手段，但远处转移及局部复发仍是治疗失败的主要原因，靶向治疗具有高效、低毒的特性，是鼻咽癌研究热点之一〔1,2〕。长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，研究发现lncRNA与鼻咽癌的发展、侵袭、转移等相关，例如，下调lncRNA LINC01420抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭〔3〕；lncRNA DGCR5通过调节miR-21/核转录因子(NF)-κB途径促进鼻咽癌进展〔4〕。DiGeorge综合征关键区域基因(DGCR)5被发现在许多癌症中低表达，与患者不良预后相关，如肝癌〔5〕和膀胱癌，DGCR5通过转录促进P21表达抑制膀胱癌进展〔6〕。DGCR5还通过抑制miR-22-3p促进肺腺癌进展〔7〕。然而DGCR5在鼻咽癌中作用及其机制尚不清楚。此外，miR-21已被证实作为一个致癌基因在多种癌症中异常表达，如miR-21通过靶向抑制肿瘤抑制基因受磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)促进前列腺癌细胞的增殖和侵袭〔8〕。miR-21通过PTEN/PDCD4诱导SK-N-SH细胞凋亡，抑制细胞增殖〔9〕。据报道，miR-21在鼻咽癌组织中高表达，信号传导及转录激活蛋白(STAT)3激活miR-21通过靶向PTEN促进鼻咽癌细胞增殖并抑制细胞凋亡〔10〕；miR-21抑制剂通过下调B细胞淋巴瘤(Bcl)-2表达抑制鼻咽癌细胞的增殖和迁移〔11〕。然而DGCR5和miR-21在鼻咽癌中的相互关系还不确定，本实验旨在研究DGCR5可能通过调控miR-21对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1购自中国科学院上海细胞库；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibico公司；Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒、凋亡试剂盒、放射免疫沉淀试验(RIPA)蛋白裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司；Transwell小室、基质胶购自美国BD公司。收集邢台市人民医院确诊为鼻咽癌患者24例，然后将患者癌旁组织、鼻咽癌组织冷冻保存在液氮罐内，本研究已获得医院伦理委员会批准同意。

1.2方法

1.2.1细胞培养 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1，于37℃、5%CO2培养。

1.2.2细胞转染与分组 取对数期细胞CNE-1、HNE-1接种于96孔板中，细胞融合至80%，将si-NC、si-DGCR5、pcDNA-NC、pcDNA-DGCR5、anti-miR-NC、anti-miR-21质粒分别转染至CNE-1、HNE-1细胞中，记为si-NC组、si-DGCR5组、pcDNA-NC组、pcDNA-DGCR5组、anti-miR-NC组、anti-miR-21组；将pcDNA-DGCR5分别与mimic-NC、mimic-miR-21共转染至CNE-1、HNE-1细胞中，记为pcDNA-DGCR5+mimic-NC组、pcDNA-DGCR5+mimic-miR-21组；转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.2.3qRT-PCR检测DGCR5和miR-21表达水平 提取鼻咽癌组织、癌旁组织和各组细胞总RNA，反转录成cDNA，荧光定量试剂盒说明书操作步骤进行PCR扩增。DGCR5和miR-21相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.4MTT比色法检测细胞增殖活力 各组细胞培养24、48、72 h时，加20 μl MTT溶液，孵育4 h；弃去培养基，加150 μl DMSO，酶标仪检测490 nm处吸光度(OD)值。

1.2.5Transwell检测细胞迁移和侵袭 各组细胞用无血清培养基重悬细胞(2×104个/ml)。细胞迁移：取200 μl细胞悬液接种Transwell上室，培养24 h，取出小室，用棉签轻轻擦去上层细胞，加4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜观察并拍照计数。细胞侵袭：以1∶5比例稀释基质胶，铺于Transwell上室，干燥后，按照细胞迁移实验步骤操作。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗2次，加结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min。流式细胞仪检测凋亡情况。实验重复3次。

1.2.7荧光素酶报告基因实验 数据库显示DGCR5与miR-21结合位点。构建DGCR5野生型(Wt)、突变型(Mut)荧光素酶表达载体DGCR5-Wt和DGCR5-Mut。将DGCR5-Wt和DGCR5-Mut分别与mimic-NC、mimic-miR-21共转染至CNE-1、HNE-1细胞中，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验重复3次。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌组织和细胞系中的表达量 鼻咽癌组织DGCR5表达水平显著低于癌旁组织，miR-21表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，见表1；鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2、CNE-1、HNE-1、HONE-1中DGCR5的表达水平均显著低于人永生化鼻咽上皮细胞NP69，miR-21表达水平均显著高于人永生化鼻咽上皮细胞NP69(P<0.05)，见表2。

表1 lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌组织和细胞系中的表达

表2 lncRNA DGCR5、miR-21在鼻咽癌细胞系中的表达

2.2过表达lncRNA DGCR5对鼻咽癌细胞增殖凋亡的影响 pcDNA-DGCR5组鼻咽癌细胞CNE-1、HNE-1中DGCR5的表达水平、细胞凋亡率均显著高于pcDNA-NC组(P<0.05)，24 h后细胞活力均显著低于pcDNA-NC组(P<0.05)，见表3、表4。

表3 过表达lncRNA DGCR5对CNE-1细胞增殖凋亡的影响

表4 过表达lncRNA DGCR5对HNE-1细胞增殖凋亡的影响

2.3过表达lncRNA DGCR5对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响 pcDNA-DGCR5组鼻咽癌细胞CNE-1、HNE-1中迁移和侵袭数量均显著低于pcDNA-NC组(P<0.05)，见图1、表5。

图1 过表达lncRNA DGCR5对鼻咽癌细胞CNE-1、HNE-1迁移、侵袭的影响(结晶紫，×200)

2.4lncRNA DGCR5可以与miR-21靶向结合 图2通过在线软件预测到DGCR5与miR-21存在结合位点。mimic-miR-21组DGCR5-Wt鼻炎癌细胞CNE-1、HNE-1的荧光素酶活性显著低于mimic-NC组(P<0.05)；而DGCR5-Mut鼻炎癌细胞CNE-1、HNE-1的荧光素酶活性差异不显著(P>0.05)，见表6。si-DGCR5组鼻炎癌细胞CNE-1、HNE-1中miR-21的表达水平显著高于si-NC组(P<0.05)；pcDNA-DGCR5组鼻炎癌细胞CNE-1、HNE-1中miR-21的表达水平显著低于pcDNA-NC组(P<0.05)，见表7。

图2 DGCR5与miR-21结合位点

表6 双荧光素酶报告实验

表7 lncRNA DGCR5靶向调控

2.5抑制miR-21表达对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 anti-miR-21组CNE-1、HNE-1细胞中miR-21表达水平、24 h后细胞活力、迁移和侵袭数量均显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率显著高于anti-miR-NC组(P<0.05)，见表8、表9。

表8 抑制miR-21表达对CNE-1细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

表9 抑制miR-21表达对HNE-1细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

2.6过表达miR-21逆转了过表达lncRNA DGCR5对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡 pcDNA-DGCR5+mimic-miR-21组鼻咽癌细胞CNE-1、HNE-1中miR-21表达水平、24 h后细胞活力、迁移和侵袭数均显著高于pcDNA-DGCR5+mimic-NC组(P<0.05)，细胞凋亡率显著低于pcDNA-DGCR5+mimic-NC组(P<0.05)，见表10、表11。

表10 过表达miR-21逆转了过表达lncRNA DGCR5对CNE-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡

表11 过表达miR-21逆转了过表达lncRNA DGCR5对HNE-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡

3 讨 论

据报道，lncRNA在多种肿瘤中起关键作用，可作为肿瘤生物标志物。lncRNA DGCR5作为一种肿瘤抑制因子在癌症中起作用，如过表达DGCR5抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭〔12〕。此外，DGCR5在胃癌患者癌组织及血浆中表达均显著降低，DGCR5上调能抑制胃癌细胞增殖及转移，促进胃癌细胞凋亡〔13〕。本研究结果说明DGCR5可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。这与DGCR5在其他肿瘤中的作用相符。研究证实DGCR5可能作为miRNA的ceRNA，调节miRNA内源性靶标的表达，从而在许多癌症的发生和发展中发挥重要作用，如DGCR5通过靶向miR-1180调节肺癌的增殖、迁移和侵袭〔14〕。DGCR5通过海绵miR-2861抑制甲状腺癌细胞的增殖和迁移〔15〕。

miRNA可以作为抑癌基因或致癌基因在肿瘤中起作用。本研究结果说明miR-21在鼻咽癌发生和发展中可能作为肿瘤促进因子，提示抑制miR-21可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。Zhou等〔16〕发现miR-21下调减弱鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭。miR-21下调增强鼻咽癌的放射敏感性〔17〕。研究发现LncRNA-MEG3通过调控miR-21的表达抑制胃癌增殖和转移〔18〕；miR-21高表达通过调控PTEN促进宫颈癌细胞增殖〔19〕；miR-21通过沉默LATS1促进肾癌细胞和肿瘤干细胞表型的增殖和转移〔20〕。

综上，lncRNA DGCR5过表达可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡；可能与靶向调控miR-21有关，可作为鼻咽癌诊断和预后的生物标志物。