C9orf72介导的小胶质细胞功能异常与肌萎缩性侧索硬化和额颞叶痴呆相关性研究进展

郭冬芬 禹文峰 姚源蓉

(1贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；2贵州省人民医院神经内科)

肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)都是一种渐进性、致死性的神经退行性疾病，二者都伴有神经元的丢失且在临床表现、病理机制、神经行为特征和遗传病因上有部分重叠。二者的发病机制尚不明确，据报道有基因突变，包括9号染色体开放阅读框72基因(C9orf72)、TAR DNA结合蛋白基因 (TARDBP)和肉瘤融合蛋白基因(FUS)等。其中C9orf72 G4C2六核苷酸重复(HRE)是最常见的导致ALS和FTD发生的基因突变〔1,2〕。由于运动神经元的丢失是ALS和FTD的主要病理标志，因此早期的研究主要集中在以神经元病变为中心，然而最近的研究表明神经退行性疾病中存在非神经元细胞类型的病变，包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞〔3〕。野生型C9orf72在囊泡运输和溶酶体功能中发挥重要作用，研究发现C9orf72突变与神经炎症和吞噬异常相关，神经炎症是ALS和FTD的病理性特征，特点是小胶质细胞的激活并释放促炎症因子与神经毒性物质；其次，自噬与吞噬之间存在相似性，自噬异常会影响小胶质细胞的吞噬功能。本文就C9orf72通过影响小胶质细胞的功能从而参与ALS和FTD的发生发展进行综述。

1 小胶质细胞与神经炎症

小胶质细胞是先天免疫系统的组成部分，占中枢神经系统细胞的5%～12%〔4〕。正常情况下，小胶质细胞能够感知其周围的环境，通过其分支来实时监测微环境，寻找潜在的信号，采取进一步的行动。同时，小胶质细胞还能分泌多种神经营养因子，如神经生长因子和碱性成纤维细胞生长因子来促进突触形成，因此正常状态下的小胶质细胞对于神经元的发育和维持很重要〔5〕。但当受到刺激时，小胶质细胞会被激活，根据其受到的刺激不同，可以极化为不同的表型。分别为促炎症型(M1型)和抗炎症型(M2型)。M1型小胶质细胞能产生促炎症介质，包括一氧化氮合酶、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子α，对神经元产生毒性作用〔6〕。而M2型具有吞噬作用，同时还能产生抗炎因子及神经营养因子，能减少神经系统的炎症反应，促进神经修复，起到神经保护作用〔7〕。因此激活的小胶质细胞对于调控神经炎症具有重要意义。研究发现炎性级联反应可能是ALS和FTD发病机制之一，在阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)患者大脑中，都发现有激活的小胶质细胞〔8〕，且两种疾病中都伴随炎症发生。用环氮氧化物四甲基哌啶处理ALS模型鼠(SOD1G93A转基因鼠)，可缓解ALS模型鼠的体重下降、改善运动缺陷及减少运动神经元的丢失。且检测到给药后，脊髓前角的小胶质细胞反应活性显著降低，同时炎症因子的基因表达也相应下调，这表明四甲基哌啶可能通过减少小胶质细胞的活化及其介导的神经炎症从而延缓ALS的发展〔9〕。因此，激活的小胶质细胞介导的神经炎症可能直接影响包括ALS在内的多种神经退行性疾病的发生发展〔10〕。

2 C9orf72与ALS/FTD的神经病理

C9orf72的G4C2六核苷酸重复扩增，是ALS和FTD最常见的遗传病因。野生型的C9orf72能翻译成鸟嘌呤核苷酸交换因子，参与调节神经元和免疫细胞的囊泡转运和自噬〔11〕。在正常人体内，该基因为2～3个重复，而在发生C9orf72突变的ALS患者体内，其重复为66～4 400个。C9orf72 HRE造成疾病的可能机制有3个，包括由于C9orf72单倍表达不足造成功能丢失、由C9orf72扩增重复序列而产生的核糖核酸(RNA)团簇、与重复相关的非抗胸腺细胞球蛋白(ATG)依赖翻译产生双肽重复蛋白(DRPs)〔12〕。这些DRPs主要有5种，包括poly-GA、poly-GP、poly-GR、poly-PR、poly-PA。研究发现，当发生C9orf72 HRE时，最容易受到危害的就是神经元，主要是因为发生C9orf72 HRE时，单倍体不足导致其表达下调，致使运动神经元中的溶酶体数量下降，从而导致DRPs在神经元积累对其产生毒性〔13〕，ALS病变区域包括运动皮层、额叶皮层和脊髓前角，都发现poly-GR的聚集〔14〕。除了直接危害神经元参与ALS/FTD发生，近年来还发现C9orf72 HRE与炎症相关。据Burberry等〔15〕报道，小鼠中C9orf72同源基因的功能缺失突变，可引起多种炎性因子的释放，导致致命性的自身免疫性疾病。另外，对C9orf72基因缺陷的小鼠脊髓中的小胶质细胞进行分析，结果显示促炎细胞因子白介素-1β、白介素-6表达均上调〔16〕。综上，C9orf72突变除了直接危害神经元外，还可能通过引起小胶质细胞功能异常，从而参与ALS和FTD的发生。

3 C9orf72激活小胶质细胞介导炎症

C9orf72在ALS患者退化的神经元和胶质细胞亚群中选择性高表达〔17〕。据报道发生C9orf72突变的额颞叶变性患者中CD68抗原免疫活性和小胶质细胞形态与正常对照组明显不同〔18〕。同样，C9orf72突变的ALS患者体内小胶质细胞的钙离子接头蛋白(Iba)1和CD68免疫反应性也比散发性ALS病例更高〔19〕。这提示C9orf72的突变可能会导致小胶质细胞激活。在6月龄小鼠脊髓的神经元表达Poly-GA后，检测到激活的小胶质细胞的标志物Iba1、CD68的免疫活性明显增加，而在神经元未表现出Poly-GA病变的脑部区域没有检测到CD68、Iba1活性〔20〕。同时，与野生型对照组小鼠相比，对神经元中特异性表达poly-GA的小鼠，进行poly-GA疫苗接种后，发现其脊髓中的小胶质细胞激活减少〔21〕。这表明，DRPs在神经元中积累并对其产生毒性的同时，还能激活小胶质细胞。另外，对ALS、FTD和发生C9orf72突变的ALS患者尸检额叶皮层组织进行分析，发现携带C9orf72突变的ALS患者额叶皮层中与星形胶质细胞和小胶质细胞有关蛋白显著增加，且通过对C9orf72突变的ALS患者和没有C9orf72突变的ALS患者间进行蛋白对比分析，发现在C9orf72突变的ALS患者中，有明显蛋白表达的增加或下降，且这些蛋白表达的变化与神经炎症相关，从而确定了C9orf72突变与神经炎症相关〔22〕。同样的，与正常对照组相比，神经元特异性表达poly-PR的小鼠，小脑和脊髓处激活的星形胶质细胞、小胶质细胞数量明显增加，运动皮层和脊髓中与炎症相关的3个基因，包括补体基因补体成分1q子成分A(C1qa)、CD68基因、髓样细胞触发受体2基因表达均上调，且小鼠出现运动功能障碍和神经变性〔23〕。综上，C9orf7功能异常可能通过激活小胶质细胞，严重扰乱免疫内环境，导致系统性自身免疫性疾病并引起神经炎症，进一步加重对神经元的危害，从而导致ALS和FTD相关病理。

4 C9orf72介导的自噬异常与小胶质细胞的关系

除了通过激活小胶质细胞引起神经炎症参与ALS和FTD过程，C9orf72的另一主要功能就是调控自噬。研究发现，C9orf72可以与史密斯-马盖尼斯综合征染色体候选基因(SMCR)8和WD重复域蛋白(WDR)41形成复合体共同调控自噬——溶酶体通路，C9orf72或SMCR8的表达异常，都会导致自噬异常〔24〕。当C9orf72表达下调时，自噬的功能受到影响而减弱，从而不能清除这些DRPs的聚集，如小鼠皮层神经元中敲除C9orf72，发现有反式激活反应-DNA结合蛋白(TDP)-43包涵体在神经元胞浆聚集〔25,26〕。已有报道，在多种神经退行性疾病中存在自噬功能异常，如AD、PD、亨廷顿病、ALS〔27〕。除了通过自噬影响DRPs的形成，近年来还发现C9orf72可能通过自噬异常而影响小胶质细胞的吞噬功能从而参与ALS和FTD的发生发展。作为大脑中先天免疫系统的主要参与者，小胶质细胞能协调大脑的炎症反应，对中枢神经系统的损伤做出反应，并调节可溶性炎症介质的释放及吞噬中枢神经系统中的特异性碎片〔28〕，因此小胶质细胞吞噬功能异常可能会导致神经疾病，如在小鼠和人的颞叶癫痫中都有发现小胶质细胞吞噬功能的慢性损伤〔29〕。据Nash等〔30〕报道，一种能保护神经免受氧化应激损伤的蛋白质DJ-1的表达不足会影响自噬功能，自噬功能异常后会导致小胶质细胞吞噬并清除α-核突触蛋白的能力下降。同样有研究显示，脂多糖激活Toll样受体(TLR)4后，自噬通量和自噬相关基因在小胶质细胞中的表达明显受到抑制，同时小胶质细胞的吞噬功能也受到自噬影响下降〔31〕。以上结果表明自噬异常可以影响小胶质细胞的吞噬功能。除此之外，已有研究证实，小胶质细胞中与吞噬相关的一些基因的突变会导致小胶质细胞吞噬功能的异常，参与神经退行性疾病的发生发展，如选择性在小胶质细胞表达的髓样细胞触发受体2基因突变导致功能丧失，会改变小胶质细胞的炎症应答和减弱其吞噬功能〔32〕，从而与ALS、FTD、AD、PD的发生相关。同样，在小胶质细胞和神经元中都有表达的颗粒蛋白前体基因，其突变也会导致细胞的吞噬功能异常〔33〕。另外，对C9orf72敲除的小鼠脊髓中分离的小胶质细胞进行分析，发现细胞因子白介素-1β和白介素-6水平升高，其潜在机制可能与其溶酶体功能异常相关〔16〕。由于野生型的C9orf72具有调节自噬和溶酶体功能的作用，因此推测，当C9orf72功能异常时，也可能会通过自噬异常进而影响小胶质细胞的吞噬功能，进一步加重神经变性的危害，从而参与ALS和FTD。

综上，C9orf72的G4C2六核苷酸重复扩增，是ALS和FTD最常见的遗传病因，C9orf72突变时主要危及神经元〔34〕，但近年来的研究发现C9orf72突变还可能危及非神经元细胞类型〔3〕，如在携带C9orf72突变的患者体内发现有激活的小胶质细胞，同时伴随炎症因子的释放〔19,22〕，基于这些已有的研究，本文概述了C9orf72可能通过激活小胶质细胞介导神经炎症发生，并可能影响小胶质细胞的吞噬功能，从而参与ALS和FTD的发生发展。这一途径将为ALS和FTD发生机制研究提供新思路。