黄杞总黄酮对慢性心力衰竭大鼠AT1/CARP信号通路及心肌自噬的影响

解娜 王建发 杨秀丽 殷国田 赵国安

(新乡医学院 1第三附属医院心内科，河南 新乡 453000；2第一附属医院心内科)

心力衰竭(HF)是由心脏结构或功能性疾病引起的心室充盈和/或射血功能受损所致〔1〕。血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)可导致心肌细胞肥大。AT1激活了几种细胞内信号转导途径，在没有高血压的情况下，AT1局部过表达也可能促成心肌肥大的发病机制〔2〕。心肌锚定重复蛋白(CARP)为人内皮细胞中的细胞因子(白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α)诱导型转录辅因子〔3，4〕。研究表明，CARP既是核转录的辅助因子，又是肌小节Ⅰ带中与肌动蛋白相关的伸展感觉复合体的组成部分，参与肌原纤维的组装和伸展感觉。动物模型发现肥厚型心肌细胞中CARP的表达显著上调。在因扩张型心肌病，局部缺血性心脏病和心律失常性右室心肌病导致代偿性HF的患者中也观察到相同现象〔5〕。在生理条件下，自噬可以清除心肌细胞中的衰老细胞器和受损的蛋白质，以维持心脏功能和心脏形状，在心脏病中，自噬水平的改变也可能导致受损的线粒体积聚，从而影响心脏功能〔6〕。黄杞总黄酮具有很强的抗氧化和消除自由基作用，黄杞总黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达〔7〕。黄杞总黄酮具有抗炎症、抗过敏、抑制细菌、抑制寄生虫、抑制病毒、防治肝病、防治心血管疾病、防治血管栓塞、防治心与脑血管疾病、抗肿瘤、抗化学毒物的疗效〔8〕。本研究拟探讨黄杞总黄酮对慢性HF大鼠AT1/CARP信号通路及心肌自噬的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级SD大鼠购自重庆医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(渝)2019-0011，动物使用许可证号：SYXK(渝)2019-0013，动物质量合格证号：NC00190346；雌雄不限，10～12周龄，体重220～300 g。大鼠在12∶12 h的明暗周期中饲养，并饲喂标准饮食和纯净水。本动物实验经新乡医学院第三附属医院伦理委员会批准执行。

1.2主要药物、试剂及仪器 黄杞总黄酮(原料药，纯度≥98%，南京森贝伽生物科技有限公司，批号SW30117)；缬沙坦片(北京诺华制药有限公司，规格40 mg/片，批号20190811)；细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号G0170-100T、FS-14993)；TRIzol试剂(北京柏莱斯特科技发展有限公司，批号LGTZ001)；第一链cDNA合成试剂盒(艾美捷科技有限公司，批号NGB-54400)；SYBR Green PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(凯杰生物工程深圳有限公司，批号208059)；蛋白质提取试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，批号SF2672-25、P0006)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(德国默克密理博公司，批号SVLP04703)；AT1单克隆抗体、CARP单克隆抗体、β-肌动蛋白(actin)单克隆抗体(英国Abcam公司，批号sc-22006、sc-53566、sc-0016)；羊抗鼠二抗(上海中科英沐生物科技有限公司，批号PB001F7)；增强型化学发光试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号YK-10P2)；GE 730型彩色多普勒超声诊断仪(美国通用电气公司)；BX53TR型荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；E100型光学显微镜(日本尼康公司)；7300型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(美国ABI公司)；Tanon 5200型化学发光成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.3动物建模及给药 将72只大鼠通过戊巴比妥钠腹膜麻醉，于胸骨左缘第3、4肋间开胸，暴露心脏，使用6.0无创缝合线用于结扎左前降支(LAD)冠状动脉(距左心耳和肺动脉椎体之间的主动脉根3～4 mm)。缝合胸壁后发现共8只大鼠死亡，且术后1 w，行心脏彩超检测，当左心室射血分数(LVEF)<45%视为慢性心力衰竭大鼠模型制备成功〔6〕。共成功造模64只大鼠，将造模成功的大鼠按随机数表法分成4组：模型组、缬沙坦组〔9〕(50 mg/kg)、黄杞总黄酮低、高剂量组(250、500 mg/kg)〔7〕，每组16只。另取16只无任何处理措施的大鼠为对照组。缬沙坦组、黄杞总黄酮低、高剂量组于建模成功后第1天，给予相应药物灌胃，灌胃体积10 ml/kg，对照组及模型组灌胃等体积的生理盐水，每天1次，连续给药4 w。

1.4超声心动指标的测定 使用彩色多普勒超声诊断仪进行超声检查，使用二维超声心动图显示左心室的长轴，测量与心脏功能相关的参数，如左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室短轴缩短率(FS)、射血分数(EF)。

1.5心肌自噬指数的测定 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其颈椎脱臼处死，剥离心脏，获取心肌组织。常规制作心肌组织切片，MDC法测定细胞自噬水平。操作如下：将切片用PBS洗涤5 min两次后，向每个切片中加入0.05 mmol/L MDC，在37℃的保护下避光孵育1 h，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，将载玻片固定在用PBS洗涤并固定后在4%多聚甲醛中放置15 min。通过荧光显微镜观察细胞，细胞质内出现酸性自噬小体(绿色)，说明细胞发生自噬。每个标本捕获5张图像，记录心肌细胞和自噬细胞的总数并计算平均值。自噬指数的计算公式如下：自噬指数=自噬细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.6大鼠心肌病理结构观察 将心肌组织制备石蜡切片(5 m/片)，采用HE试剂盒染色后置于光学显微镜下观察。

1.7qRT-PCR测定心肌组织AT1、CARP mRNA水平 TRIzol试剂从大鼠心肌组织提取总RNA，使用第一链cDNA合成试剂盒将RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green PCR Kit试剂盒进行定量PCR扩增。引物由碧云天生物技术研究所合成。AT1引物正向5′-GTTCTGGAATTGCGTGCTTT-3′，反向5′-TGCTTCATGAGCCAAGTCAC-3′；CARP引物正向5′-TTGATGTCCAGCTGAGTYCCT-3′，反向5′-CTTGAAGGGATCGCTCATGT-3′。β-actin用作内部对照，β-actin引物正向5′-TGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3′、反向5′-TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。循环程序如下：95℃ 2 min，然后在95℃变性持续5 s 30个循环，在56℃退火30 s，在68℃延伸30 s。PCR总反应体积为20 μl，包含10 μl SYBR Green PCR Kit，0.8 μl正向引物，0.8 μl反向引物，2 μl cDNA模板和6.4 μl ddH2O。采用2-ΔΔCt法计算AT1、CARP mRNA的相对表达水平。

1.8Western印迹测定心肌组织AT1、CARP蛋白水平 将心肌组织样品裂解30 min，并使用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白，通过Bradford试剂盒测定蛋白质浓度，随后将等量的蛋白质(20 μg)加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的每个泳道上，电泳在80 V(堆积凝胶)/ 120 V(分离凝胶)的恒定电压下进行，将蛋白质样品电印迹到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉将膜封闭1 h，然后加入AT1、 CARP、β-actin一抗(均为1∶1 000)在4℃下孵育过夜。加入羊抗鼠二抗(1∶5 000)与膜在室温下孵育1 h，通过增强型化学发光试剂进行观察。使用化学发光成像系统获取结果，计算AT1、 CARP蛋白和β-actin蛋白(作为内部对照)的密度比，作为相对表达量。

1.9统计学分析 采用SPSS24.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组大鼠心功能指标比较 与对照组比较，模型组大鼠LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。与模型组比较，缬沙坦组、黄杞总黄酮低高剂量组LVIDd、LVIDs明显降低，FS、EF明显升高；且黄杞总黄酮高剂量组LVIDd、LVIDs明显低于黄杞总黄酮低剂量组，FS、EF明显高于黄杞总黄酮低剂量组(P<0.05)。与缬沙坦组比较，黄杞总黄酮低剂量组LVIDd、LVIDs升高，FS、EF降低(P<0.05)。黄杞总黄酮高剂量组LVIDd、LVIDs、FS、EF与缬沙坦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠心肌细胞自噬情况比较 与对照组〔(8.96±3.54)%〕比较，模型组大鼠自噬指数水平明显升高〔(56.96±4.29)%,P<0.05〕。与模型组比较，缬沙坦组〔(21.63±4.99)%〕、黄杞总黄酮低剂量组〔(41.63±5.96)%〕、黄杞总黄酮高剂量组〔(20.47±5.87)%〕自噬指数水平明显降低，且黄杞总黄酮高剂量组自噬指数水平明显低于黄杞总黄酮低剂量组(P<0.05)。与缬沙坦组比较，黄杞总黄酮低剂量组自噬指数水平明显升高(P<0.05)。黄杞总黄酮高剂量组自噬指数水平与缬沙坦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 各组大鼠心肌细胞自噬显微观察(甲基绿染色，×400)

2.3各组大鼠心肌组织病理结构比较 对照组心肌结构正常；模型组心肌横纹紊乱，心肌细胞明显肿胀，出现空泡情况(箭头所示)，肌纤维溶解明显，有明显炎症细胞浸润；缬沙坦组及黄杞总黄酮高剂量组心肌炎症细胞浸润减少，心肌纤维排列整齐；黄杞总黄酮低剂量组心肌仍有明显病理变化。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织病理(HE染色，×400)

2.4各组大鼠心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平比较 与对照组比较，模型组大鼠心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，缬沙坦组、黄杞总黄酮低、高剂量组心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平明显降低；且黄杞总黄酮高剂量组心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平明显低于黄杞总黄酮低剂量组(P<0.05)。与缬沙坦组比较，黄杞总黄酮低剂量组心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平明显升高(P<0.05)。黄杞总黄酮高剂量组心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平与缬沙坦组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图3。

表2 各组大鼠心肌组织AT1、CARP mRNA及蛋白水平比较

1～5：对照组，模型组，缬沙坦组，黄杞总黄酮低剂量组，黄杞总黄酮高剂量组图3 各组大鼠心肌组织AT1、CARP蛋白表达

3 讨 论

黄杞总黄酮是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其他包括双氢黄(醇)、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。由于黄杞总黄酮分子量小，可被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，具有保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能〔10，11〕。黄杞总黄酮可有效清除体内的氧自由基，黄杞总黄酮可以抑制油脂性过氧化物的全阶段溢出，这种阻止氧化的能力是维生素E的10倍以上，这种抗氧化作用可以阻止心肌细胞的自噬〔12〕。此外，黄杞总黄酮可改善血液循环，降低胆固醇，这些作用大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可改善心脑血管疾病的症状〔13〕。本研究说明，黄杞总黄酮对慢性HF大鼠心功能机心脏病理改变有明显保护作用，这与上述讨论一致。

心脏在病理情况下，随着内部环境和应力条件的变化(例如缺乏能量、氧化损失和线粒体膜通透性过渡孔的开放)，心肌细胞自噬将相应增强。研究表明，自噬对于维持心脏功能至关重要，心肌细胞自噬水平的升高可引起细胞器功能障碍，例如线粒体钙离子的积累〔14〕。本研究说明，黄杞总黄酮能明显降低心肌细胞自噬水平，进而保护慢性HF大鼠心功能。

AT1通过作用于心肌细胞的特定受体诱导心脏重构，AT1是G蛋白耦联受体家族成员，血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌肥大主要由AT1介导。Ang Ⅱ的正性变力和变力作用会增加耗氧量〔15〕。AT1激活特定的酪氨酸激酶途径并引起酪氨酸磷酸化，然后激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白酪氨酸激酶(JAK)。JNK可以通过培养的新生大鼠心肌细胞中的Ang Ⅱ通过AT1激活〔16〕。ERK是促分裂原活化蛋白激酶家族的关键成员，与Ang Ⅱ诱导的心肌肥大密切相关。JAK/转录激活因子(STAT)途径是与Ang Ⅱ诱导的心肌肥大密切相关的另一种途径，它不同于促细胞分裂剂激活的蛋白激酶家族〔17〕。细胞实验发现缺氧的H9C2细胞及缺血/再灌注(I/R)期间的大鼠心肌中AT1表达持续升高。在阿霉素诱导的心肌病心肌中也观察到AT1表达升高，与心肌细胞自噬和细胞丢失有关。最近的研究表明，AT1可能加重Ang Ⅱ或压力超负荷引起的心肌细胞自噬〔18〕。越来越多的证据表明细胞自噬发生在各种心血管疾病中，包括肥厚性心肌病，缺血性心脏病和充血性心力衰竭。心肌细胞自噬促进心脏疾病的发展和进程，是重要的治疗靶点〔19〕。研究发现CARP在大鼠胚胎心脏H9C2细胞中表达，与DNA损伤基因153(GADD153)基因密切相关，并受到缺氧的双重调控，GADD153过表达加重H9C2细胞自噬，而CARP表达随之下调；还显示出CARP通过抑制ERK1/2和转化生长因子(TGF)-β信号传导途径来减轻心肌肥大，而与心肌细胞自噬无关〔20〕。CARP还作为核转录辅因子，已被证明对心脏基因表达和心脏形态发生负调控。动物实验证明了CARP在受缺氧/复氧(H/R)损伤的培养的心肌细胞中均下调，它们都是公认的自噬模型〔21〕。本研究结果提示，黄杞总黄酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，进而抑制AT1 CARP信号通路的激活，从而抑制心肌自噬。

综上，黄杞总黄酮对慢性HF大鼠心肌功能及心脏病理改变有明显保护作用，能明显降低心肌细胞自噬水平；其机制可能与黄杞总黄酮可抑制心肌AT1、CARP mRNA和蛋白水平，进而抑制AT1/CARP信号通路的激活有关。