固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠气道上皮紧密连接蛋白及CCSP的影响

姜越,张宇林，董盈妹,严花,赵霞

(1.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029；2.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023)

哮喘是儿童时期常见的慢性疾病之一,以慢性气道炎症和气道高反应性为主要临床特点[1]。目前全球哮喘患者有3亿左右,其中儿童约占三分之一,我国是哮喘病死亡率较高的国家。我国完成的第3次儿童哮喘流行病学研究显示,我国儿童哮喘的患病率呈逐年增长的趋势[2]。

吸入糖皮质激素等是西医防治哮喘的主要手段[3]。有研究表明,糖皮质激素长期使用给哮喘患者带来的副作用相比安慰剂而言要明显很多,而且还存在对其不敏感的难治型患者[4-5]。中医药防治哮喘在多年临床应用中获得广泛认可,固本防哮饮是我国著名中医儿科专家江育仁教授的经验方,临床研究表明其防治哮喘疗效突出[6]。课题组前期研究证实,固本防哮饮可有效减轻哮喘缓解期小鼠气道炎症[7],降低气道高反应性,改善小鼠肺功能[8]。

近年来研究表明,在哮喘复杂的发病机制中,上皮损伤因素是不可忽视的诱因之一,哮喘患者气道上皮屏障完整性受损已被证明确实存在,即“缺陷上皮”假说[9]。从修复哮喘患者受损气道上皮屏障功能方面探讨固本防哮饮防治哮喘的作用机制十分必要,故本次实验通过研究固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠气道上皮紧密连接蛋白和CCSP的作用,探讨固本防哮饮对气道上皮屏障完整性的修复作用及其防治哮喘的可能机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雌性Balb/c小鼠36只,4～6周龄,体质量16～18 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,本研究经由南京中医药大学动物伦理委员会批准,伦理号:202012A054。

1.2 药物

孟鲁司特钠片:10 mg·片-1,购自杭州默沙东药业股份有限公司,批号:K004567。固本防哮饮:炙黄芪15 g，党参10 g，白术10 g，茯苓10 g，煅牡蛎15 g，蝉蜕6 g，陈皮6 g，防风3 g，辛夷6 g，五味子6 g，生甘草3 g,以上11味药材购自江苏省中医院。药物浸泡于10倍量冷水中30 min,煎30 min后滤出;第2煎取8倍量水煎30 min后滤出,合并2次药液,使用旋蒸仪浓缩至生药含量3 g·mL-1,密封4 ℃储存备用。

1.3 试剂与仪器

卵蛋白(OVA,批号:326A058),美国Sigma公司;兔抗小鼠桥粒芯胶蛋白(Desmocollin)抗体(批号:MAB7367-SP)、兔抗小鼠闭锁小带蛋白-1(ZO-1)抗体(批号:bs-1329R)、兔抗小鼠闭合蛋白(Occludin)抗体(批号:ARG40500)、山羊抗兔多克隆二抗(批号:ab6721),美国Abcam公司;鼠抗β-actin抗体(批号:YM1206),美国ImmunoWay公司;小鼠CCSP ELISA试剂盒(批号:F9206-A);BCA蛋白定量试剂盒(批号:23227),美国Thermo Scientific公司;DEPC水(批号:R0021)、苏木精-伊红(HE)染色液(批号:C0105)、RIPA裂解液(批号:P0013B),南京碧云天生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒(批号:9109)、逆转录试剂盒(批号:RR306A)、Real-time PCR定量试剂盒(批号:RR820A),加拿大ABM公司。

ChemiDocTMMP化学发光成像仪(美国Bio-Rad);PowerPac Basic电泳仪(美国Bio-Rad);Trans-Blot半干转膜仪(美国Bio-Rad);Infinite 200 pro酶标仪(瑞士Tecan);Biophotometer蛋白核酸分析仪(德国Eppendorf)；PCR逆转录仪(德国eppendorf);Quantstudio 7 Flex PCR系统(美国Life technologies)。

2 方法

2.1 造模、分组及给药

参照课题组前期造模方法[10]。36只小鼠随机分成正常组、模型组、固本防哮饮低剂量组、固本防哮饮中剂量组、固本防哮饮高剂量组、孟鲁司特钠组,每组6只。适应性饲养1周后,第1天和第8天给正常组以外的小鼠予0.2 mL OVA致敏液腹腔注射;从第15天起,每天给予2.5%OVA溶液雾化吸入,每日1次,每次30 min,共14 d。随后在第32、35、38、41、45、48、51、54天以同样的方法雾化激发。在第29、42、55天时予RSV 50 μL滴鼻。

从第56天开始,正常组、模型组给予双蒸水20 mL·kg-1灌胃,固本防哮饮低、中、高剂量组分别给予12、24、36 g·kg-1固本防哮饮灌胃,孟鲁司特钠组给予孟鲁司特钠2.6 mg·kg-1灌胃,每日1次,共28 d。末次给药后24 h,麻醉脱颈椎处死小鼠,收集样本。实验共84 d。

2.2 取材

处死小鼠,结扎小鼠右肺,使用0.5 mL PBS对小鼠左肺进行灌洗,重复3次,收集3次支气管肺泡灌洗液(BALF),4 ℃ 1 000 r·min-1离心10 min,收集上清液,分装后置于-20 ℃保存备用。取右肺中叶浸泡于4%多聚甲醛中固定,用于制备肺组织石蜡切片,未使用的右肺组织,置-80 ℃冰箱冻存,待测。

2.3 肺组织病理学及免疫组织化学检测

制备小鼠肺组织石蜡切片,进行HE染色,观察血管及气道周围炎症浸润情况。炎症评分方法参考文献[10]:0级=无炎症;1级=偶尔出现炎症细胞;2、3和4级表明大多数支气管或血管分别被薄的1～2细胞层、中等的3～5细胞层或厚(>5)的炎症细胞层包围。使用免疫组化检测试剂盒,观察ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达及分布情况。随机选择3个不同视野,Image J软件统计阳性染色面积。

2.4 Western blot检测肺组织ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达

每组称取10～15 mg肺组织,加入裂解液,充分研磨,冰上裂解30 min,转移至1.5 mL EP管,4 ℃ 13 000 r·min-1离心30 min,取上清液,BCA法测定蛋白浓度,蛋白浓度设定为2 μg·μL-1,加水、上样缓冲液、样本,混匀,100 ℃预热5 min进行蛋白变性,冰盒上冷却后-20 ℃备用。配制10%分离胶和5%积层胶,加样,电泳;电泳后湿转膜;转膜后置摇床上用奶粉封闭1 h,用1×TBST洗膜3次,每次10 min,分别加入按1∶5 000、1∶5 000、1∶3 000比例稀释好的ZO-1、Occludin、Desmocollin一抗,4 ℃过夜;洗膜同前,常温下在摇床上孵育二抗1 h,洗膜同前,配制曝光液,上机,曝光。用Image J软件处理各条带,将目的蛋白灰度值与内参灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2.5 qPCR检测肺组织ZO-1、ZO-2、纽带蛋白(Vinculin)、连环蛋白(Catenin)mRNA表达

按照总RNA试剂盒步骤抽提肺组织RNA,紫外分光光度计测定吸光度及浓度。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。参照逆转录试剂盒进行逆转录,所得cDNA存于-20 ℃冰箱中备用。扩增步骤参照试剂盒进行。结果以内参GAPDH进行校准,采用2-ΔΔCt法对结果进行数据处理。

表1 qPCR引物序列

2.6 ELISA法检测CCSP表达水平

称取10～15 mg的肺组织,按体积加入PBS,使用研磨仪充分研磨,4 ℃ 15 000×g离心取上清液,使用BCA试剂盒检测总蛋白浓度,终浓度定为3 μg·μL-1。分别检测小鼠BALF和肺组织匀浆中的CCSP的表达水平,具体操作参照小鼠CCSP ELISA试剂盒说明书。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 各组肺组织病理观察

肺组织病理结果显示,模型组肺组织病理损伤程度较正常组明显加重,支气管及其血管周围伴行以嗜酸粒细胞、中性粒细胞及巨噬细胞为主的多灶性炎性细胞浸润,同时可见血管及支气管壁增厚。与模型组比较,固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特钠组小鼠肺组织病理损伤情况得到改善,同时血管及支气管周围炎症细胞浸润减轻,其中固本防哮饮中、高剂量组效果显著(P<0.05,P<0.01)。见图1。

注:与正常组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01。±s,n=3。

3.2 各组肺组织ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达

Western blot结果显示,模型组中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达水平较正常组均下降,且具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比,固本防哮饮各剂量组中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达水平均显示出不同程度的上调,固本防哮饮中剂量组中ZO-1、Desmocollin蛋白表达具有显著性差异(P<0.05,P<0.001),固本防哮饮高剂量组中Desmocollin蛋白表达具有显著差异(P<0.001),固本防哮饮低剂量组中Occludin蛋白表达具有显著差异(P<0.05),孟鲁司特钠组、固本防哮饮各剂量组间比较,无统计学意义(P>0.05)。结果见图2。

注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,###P<0.001。±s,n=3。

免疫组化结果显示,ZO-1、Occludin、Desmocollin在正常组小鼠肺组织上皮细胞和胞浆中大量表达,且排列紧密、有序；模型组中3种蛋白的表达量明显减少(P<0.01,P<0.001),排列松散、无序。与模型组相比,固本防哮饮各剂量组及孟鲁司特钠组中Occludin、Desmocollin的表达量均显著回调(P<0.001),固本防哮饮中剂量组中ZO-1表达显著上调(P<0.05)，排列渐趋有序、紧密。结果见图3。

3.3 肺组织中的ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA表达

模型组中ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA表达水平较正常组均显著下降(P<0.05，P<0.01);与模型组相比,固本防哮饮高剂量组中上述指标的mRNA水平均显著上调(P<0.05);孟鲁司特钠组、固本防哮饮各剂量组间比较,无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 肺组织中ZO-1、Vincullin、Catenin、ZO-2 mRNA表达(±s,n=3)

3.4 肺组织及BALF中CCSP的表达

与正常组相比,模型组BALF和肺组织中CCSP表达水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);固本防哮饮各剂量组与模型组相比,BALF及肺组织中CCSP的表达呈上升趋势,其中固本防哮饮低、高剂量组CCSP的表达差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.001)。孟鲁司特钠组、固本防哮饮各剂量组间比较,无统计学意义(P>0.05)。结果见图4。

注:与正常组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,###P<0.001。±s,n=3。

4 讨论

哮喘气道的慢性炎症由多种组织参与并伴有细胞异常堆积和/或募集,以嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、气道上皮细胞(AEC)、气道平滑肌细胞等常见[11]。其中AEC是抵御各种过敏原和致病因素的第一道防线。有研究证实哮喘患者上皮功能存在普遍的缺陷,这种缺陷会进一步加重哮喘气道的损伤、炎症反应、气道重塑的表现[12]。因此有学者认为哮喘的发病和预后与气道上皮持续损伤以及随后的支气管上皮细胞修复不当密切相关[13]。修复损伤的上皮细胞屏障作用及功能,有助于哮喘的预防与恢复。

AEC的基本结构包括具有纤毛结构的纤毛细胞、具有分化修复功能的基底细胞、具有分泌功能的Club细胞(过去称作Clara细胞)和杯状细胞以及少量的刷细胞和神经内分泌细胞,AEC间存在由紧密连接(TJs)、半桥粒和黏附连接(AJ)等构成的多种连接结构,这些结构形成物理屏障并维持细胞的极性[14]。TJs位于相邻上皮间细胞内连接复合体的最上缘,在细胞周围形成保护环,主要成分包括:Occludin、claudin、闭锁小带蛋白(ZOs)和连接黏附分子(JAMs)[15-16]。TJs中首批被发现的蛋白是Occludin蛋白,它与ZO-1、ZO-2在维持肺泡结构稳定性和通透性中相辅相成。但TJs对于细胞间隙的封闭作用并不是绝对的,在上皮细胞的侧面和紧密连接的下方有一种连续的带状AJ,Catenin是AJ形成的关键成分,与钙黏蛋白E(E-cadherin)共同参与细胞黏附、生长、增殖等过程,与Desmocollin相连,在细胞间形成致密的骨架网络。以上结构共同构成紧密完整的上皮屏障,有效阻隔过敏原等致病因素。研究表明,过敏原可以诱导哮喘患者的气道上皮损伤和屏障功能障碍,同时下调几种TJ和AJ蛋白[17-18]。因此AEC间连接结构完整性的缺陷或功能紊乱会成为诱导哮喘发生的直接导火索。

CCSP具有抗炎、抗纤维化的作用,是重要的内源性抗炎因子,在Club细胞特异性表达中占据标志性的地位,它在维持远端呼吸道上皮完整性和修复上皮黏膜损伤中起重要作用[19-20]。研究表明Club细胞是气道上皮损伤修复的干/祖细胞,CCSP可通过抑制成纤维细胞迁徙,降低磷脂酶A2(Pla2)活性,减少白三烯(LT)产生,从而预防哮喘气道重塑的发生[21]。有学者前期研究表明,在OVA诱导的哮喘小鼠模型中,Club细胞的增殖可随糖酵解途径的中断而停滞,这会大大减缓气道上皮损伤后炎症消退的进程[22]。临床研究表明，哮喘急性发作期儿童CCSP的水平明显低于健康儿童[23]。综上均说明CCSP对哮喘气道上皮炎症损伤、呼吸道重塑等具有关键的保护作用。

固本防哮饮是江苏省中医院江育仁教授在“扶正固本”思想的指导下,由玉屏风散和异功散加减而来,方中黄芪为君药，行补肺固表止汗之功；党参、白术、茯苓、陈皮同为臣药；防风、辛夷、蝉蜕、五味子为佐药; 煅牡蛎、生甘草为使药。益气固表，健脾助运，标本兼顾，祛邪不伤正，共奏补肺固表，健脾化痰之功。有课题组通过临床随机对照试验发现,使用固本防哮饮联合平喘敷贴治疗哮喘缓解期儿童的临床有效率高于使用布地奈德福莫特罗粉吸入剂以及沙丁胺醇气雾剂[24]。同时有研究证实,固本防哮饮中的君药黄芪的主要成分黄芪甲苷,可以抑制TNF-α和ORMDL3过表达所引起的Sphk1的激活,减轻上皮细胞屏障功能的损伤,进而达到缓解炎症,防治哮喘的目的[25]。

本实验结果发现,经固本防哮饮干预的哮喘缓解期小鼠肺组织病理损伤较模型组明显减轻,血管及支气管周围炎症浸润情况好转,其中固本防哮饮中、高剂量组疗效显著，提示固本防哮饮具有减轻哮喘缓解期小鼠肺组织炎症的作用。此外,模型组中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达较正常组均出现不同程度的下调,固本防哮饮各剂量组中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表达水平呈回调趋势；同时模型组中ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA 的表达较正常组显著降低，而固本防哮饮可以增加ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin的mRNA表达水平。以上结果均说明固本防哮饮可能对哮喘缓解期小鼠气道上皮紧密连接结构具有保护作用。同时固本防哮饮可以上调哮喘缓解期小鼠BALF及肺组织中CCSP的表达，这可能是其修复损伤上皮,恢复上皮屏障完整性,减轻哮喘慢性气道炎症反应的作用机制。

因此,固本防哮饮可能是通过恢复气道上皮紧密连接结构和渗透性,修复受损上皮屏障,减少过敏原及病毒微生物等的侵入,从而达到防治哮喘的功效,这也是对于中医“固表”理论内涵的阐述。但紧密连接蛋白在固本防哮饮防治哮喘作用机制中扮演的具体角色需要进一步研究。