黄龙止咳颗粒治疗哮喘的网络药理学研究及实验验证

王璇,钱桂英，凌晓颖,严花,汪受传，3，单进军,3

(1.南京中医药大学中医儿科学研究所,江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学常熟附属医院,江苏 苏州 215500;3.江苏省中药高效给药系统工程中心,江苏 南京 210023)

支气管哮喘(简称哮喘),是常见的呼吸系统慢性疾病[1]。其发病机制较为复杂,临床表现为气道炎症、气道高反应性和气道重塑[2-4]。截至2019年6月,我国20岁及以上人群哮喘患病率为4.2%,患病人数达到4 570万[5-6]。在中国,哮喘已经成为亟需解决的公共卫生与医疗保健问题[7]。目前治疗哮喘常用的药物有吸入糖皮质激素、长效β2受体激动剂、皮质类固醇和白三烯修饰剂[8]。临床常用的化学药物孟鲁司特钠被美国食品药品监督管理局(FDA)通报具有精神性相关不良反应,使得哮喘治疗再次面临严峻的挑战[9-10]。目前,无论是中成药单独使用还是与常规哮喘药物联合使用治疗在中国已被广泛选择。

黄龙止咳颗粒以黄芪、地龙为君药,淫羊藿、鱼腥草、射干、炙麻黄为臣药,葶苈子、山楂为佐药,桔梗为使药,具有宣肺祛痰，健脾消食，补肾益精的功效。在临床上对于支气管哮喘和儿童咳嗽变异性哮喘疗效确切。课题组前期研究表明黄龙止咳颗粒通过调控肺脂质紊乱治疗哮喘,但其分子机制尚待阐明[11]。基于此,本研究在网络药理学预测的基础上,进行了相关实验验证,以此探讨黄龙止咳颗粒治疗哮喘的潜在作用机制,为后续研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 数据库与软件 TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php),TCMID数据库(http://119.3.41.228: 8000/tcmid/),Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/),Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/),OMIM数据库(https://omim.org/),Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/),Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/),STRING数据库(https://string-db.org/),Venny2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),Cytoscape 3.7.1软件,R3.6.0软件等。

1.1.2 药物活性成分的筛选 在TCMSP数据库中检索黄龙止咳颗粒中的药物,并结合文献补充有相关药理作用的成分作为潜在活性成分。使用Pubchem数据库获得上述成分的SDF结构,保存为Canonical SMILES格式。

1.1.3 药物靶点的预测 将上述得到的SMILES格式文件导入Swiss Target Prediction数据库,以“人类”为研究物种,得到黄龙止咳颗粒的药物作用靶点。

1.1.4 疾病靶点的筛选 使用GeneCards、OMIM、Disgenet、Drugbank数据库以“asthma”为关键词进行检索,获得疾病的作用靶点。

1.1.5 潜在作用靶点的获取 在Venny2.1在线作图工具平台上分别录入黄龙止咳颗粒和哮喘的靶点,绘制韦恩图,两者的交集作为药物治疗疾病的潜在作用靶点。

1.1.6 网络模型的构建及分析 将药物的活性成分、潜在作用靶点分别导入Cytoscape软件,构建“药物-成分-靶点-疾病”相互作用网络图,使用Network Analyzer功能对药物中的主要活性成分进行分析。

1.1.7 蛋白相关作用(PPI)网络构建及分析 通过STRING数据库获取潜在作用靶点的相互作用信息,将其导入Cytoscape软件,绘制PPI网络图,根据节点的Degree值筛选出核心靶点。

1.1.8 通路富集分析 使用R语言对潜在作用靶点进行富集分析,得到GO和KEGG富集分析的条形图和通路图,分析黄龙止咳颗粒治疗哮喘的生物过程和信号通路。

1.2 实验验证

1.2.1 仪器与试剂 梯度PCR 仪(MJ mini)购自德国Eppendorf公司;倒置显微镜(DMIL)购自德国Leica公司; 超声波喷雾器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术有限公司);ECL高敏发光液、蛋白预染Maker(天能生物科技有限公司);脱脂奶粉(日本Wako公司);SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)(Biosharp生物科技有限公司);β-actin抗体(美国Proteintech公司); ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB p65、JNK、pJNK、p38 MAPK、p-p38MAPK(美国Cell Signaling公司);辣根过氧化酶标记的山羊抗兔、山羊抗小鼠及兔抗山羊二抗(南京福麦斯生物技术有限公司);小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IL-5 ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2.2 动物分组及造模 雌性C57BL/6J小鼠40只,6周龄,购自南京青龙山养殖场，动物许可证号:SCXK(苏)2017-0001,所有动物实验均经南京中医药大学动物委员会批准(编号:201903A018)。适应性饲养1周后,将小鼠随机分为4组,每组10只,分别为空白组、模型组、黄龙止咳颗粒组和孟鲁司特组。用卵清蛋白(OVA)诱导小鼠哮喘模型,分别于第1天和第14天腹腔注射含OVA 20 μg和氢氧化铝1 mg的致敏溶液0.2 mL。从第20天开始,小鼠使用超声波喷雾器连续4 d吸入3%(w/v)雾化OVA 30 min。孟鲁司特钠(1.52 mg·kg-1·d-1)和黄龙止咳颗粒(9.1 g·kg-1·d-1)。从第19天开始[11],每24 h灌胃1次,连续7 d,该剂量根据临床等效剂量换算得到。

1.2.3 组织病理学检测 取左侧肺组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定,经石蜡包埋、切片,对标本进行HE染色,镜下观察并拍照。

1.2.4 ELISA检测炎症因子含量 采集小鼠外周血血清,依据ELISA试剂盒说明书的方法步骤测定小鼠血清IL-5、TNF-α水平。

1.2.5 qPCR检测相关基因表达 采用qPCR法检测肺组织中关键靶基因IL-6、TNF、MAPK3、PTGS2、IL-1β、TLR4、MMP9、ICAM1、MPO mRNA的表达,以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。引物信息见表1,引物由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot检测相关蛋白表达 取肺组织冰上剪碎后、裂解,BCA法测定蛋白浓度,进行SDS-PAGE电泳,各样品取40 μg总蛋白上样电泳,转膜,加入稀释一抗的P38、p-P38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、NF-κB、p-NF-κB、β-actin 抗体,P38、p-P38、NF-κB、p-NF-κB、β-actin 的稀释比例为1∶1 000,ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK的稀释比例为1∶2 000,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后加入HRP标记的二抗,37 ℃孵育1 h。ECL显影,凝胶成像系统分析目的蛋白的相对表达量,目标蛋白表达量通过β-actin进行校正。

2 结果

2.1 黄龙止咳颗粒的潜在活性成分

在TCMSP数据库中设定OB≥30%、DL≥0.18,对黄芪、桔梗、麻黄、射干、葶苈子、淫羊藿、鱼腥草的有效成分进行筛选,在TCMID数据库中检索地龙、山楂,并结合文献[12-14]补充纳入黄芪中的黄芪甲苷;桔梗中的桔梗皂苷D;麻黄中的麻黄碱、伪麻黄碱,共得到潜在活性成分175个。

2.2 潜在靶点预测

将Swiss数据库中的预测靶点去重后,共得到药物靶点1 026个,中药-成分-靶点统计见表2。通过OMIM、Disgenet、Genecards、Drugbank数据库得到疾病靶点900个,在Venny2.1在线作图工具平台上分别输入药物与疾病的靶点,绘制韦恩图(图1),两者取交集后获得共同靶点153个。结果显示,黄龙止咳颗粒可能通过多个潜在作用靶点协同发挥治疗哮喘的作用。

表2 中药-成分-靶点基本信息统计表

图1 药物靶点与疾病靶点韦恩图

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建

将黄龙止咳颗粒的活性成分与153个潜在作用靶点输入Cytoscape软件,筛除与靶点无交集的孤立成分,绘制网络图(图2)。Degree排序显示,在142个与潜在靶点相互作用的活性成分中,香叶木素(Diosmetin)、芫花素(Genkwanin)、柚皮苷(naringenin)、甘草素(Liquiritigenin)等均能与20个以上的靶点相连接,推测为黄龙止咳颗粒治疗哮喘的主要活性成分。而TNF、MAPK3、PTGS2、MMP9等又能与30个以上的成分相连接,可能为黄龙止咳颗粒的主要作用靶点。上述网络分析体现了黄龙止咳颗粒多成分、多靶点的综合调节特点。

注:◇.疾病;○.靶点;□.药物;△.成分

2.4 PPI网络构建

在STRING数据库中录入153个药物-疾病共同靶点,得到蛋白相互作用的网络关系数据,并使用Cytoscape软件进行可视化分析,构建PPI网络图(图3)。

图3 PPI网络

通过Degree值排序,选取分值大于平均分的基因作为核心靶点,将前30个靶点使用R 3.6.1绘制条形图(图4)。

图4 基于PPI拓扑分析的核心靶点排序

2.5 靶点通路分析

153个潜在靶点经R语言运行后可得到GO分析(P<0.05)1 785个生物学过程、62个细胞组分、120个分子功能(图5A),生物过程主要与cAMP信号传导、炎症反应、平滑肌收缩等相关;细胞组分主要涉及免疫突触、转录因子复合物等;分子功能主要集中在类固醇激素受体活性、细胞因子受体、转录因子活性等方面。KEGG分析(P<0.05)共富集于84条信号通路(图5B),主要与炎症、免疫相关,包括TNF信号通路、IL-17信号通路、花生四烯酸代谢、cGMP-PKG信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化等。

图5 GO生物学过程分析、细胞组分分析、分子功能分析(A)和KEGG富集分析(B)

2.6 黄龙止咳颗粒对哮喘模型小鼠肺组织的影响

用HE染色法观察各组小鼠肺切片,空白组小鼠各级支气管及肺泡的结构完整, 无明显炎症细胞浸润;与空白组相比,模型组气道周围有大量浸润性炎症细胞;黄龙止咳颗粒组和孟鲁司特组炎症细胞浸润明显少于模型组。见图6。

图6 各组小鼠肺组织病理变化

2.7 黄龙止咳颗粒对哮喘模型小鼠血清TNF-α、IL-5含量的影响

文献报道哮喘小鼠由于炎症和气道高反应性,血清TNF-α和IL-5的水平通常会升高[15]。本研究结果表明,与正常组比较,模型组小鼠血清IL-5、TNF-α含量明显增高;与模型组比较,黄龙止咳颗粒组和孟鲁司特组IL-5、TNF-α含量均明显降低。见图7。

注:与空白组比较,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。±s, n=5。

2.8 黄龙止咳颗粒对哮喘模型小鼠肺组织靶基因表达的影响

通过 qPCR 检测“2.4”中拓扑分析得到的前10名核心靶点的基因表达情况,结果提示存在明显差异性表达的基因有 MAPK3、TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP9。见图8。

注:与空白组比较,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。±s, n=3。

2.9 黄龙止咳颗粒对哮喘模型小鼠肺组织中关键蛋白表达的影响

与空白组比较,模型组中磷酸化关键蛋白的含量以及磷酸化与非磷酸化蛋白的比值均增加;给予黄龙止咳颗粒后,磷酸化关键蛋白含量以及上述比值均出现不同程度的降低。见图9。

注:与空白组比较,##P<0.01,###P<0.001;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。±s, n=3。

3 讨论

本研究筛选出黄龙止咳颗粒的有效成分,并得到该药治疗哮喘的相关靶点。富集分析结果显示TNF信号通路、IL-17信号通路、花生四烯酸代谢、cGMP-PKG信号通路等可能为黄龙止咳颗粒治疗哮喘的潜在作用通路。

TNF信号通路通过激活NF-κB和MAPK信号通路发挥作用[16-18]。肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种可以直接杀伤肿瘤细胞,对正常细胞没有明显毒性的细胞因子[19]。TNF可结合的受体有2种,分别是TNFR1和TNFR2,均为Ⅰ型跨膜蛋白[20]。TNFR1在大多组织中都可以表达,并且可以通过可溶性三聚体形式将TNF完全激活[21],而TNFR2通常存在于免疫系统中,目前关于TNF信号的信息大部分来源于TNFR1[22]。TNFR1信号传导诱导许多基因的激活,这些基因主要受2个不同途径控制,即NF-κB途径和MAPK级联途径[23]。TNFR2信号传导激活NF-κB通路,包括JNK通路和依赖PI3K的NF-κB通路[24]。

NF-κB是细胞内重要的核转录因子,调节数百个基因的表达,这些基因参与调节细胞生长、分化、炎症、发育和凋亡[25]。NF-κB p65为NF-κB转录因子家族的重要成员,在炎性反应中起中心调控作用[26]。正常生理状态下,NF-κB以无活性的形式存在于胞质中,当受到其他外部抗原刺激后, 被激活的NF-κB转录入核,调控下游多种炎症相关因子表达,如TNF-α、IL-1β和COX-2等,参与各种炎症反应[27-28]。同时,这些炎症相关因子通过正反馈提高NF-κB活性,进一步促进炎症因子的产生和释放,即产生炎症放大级联反应[29-30]。NF-кB在哮喘的发病机制和导致急性和慢性炎症的机制中发挥重要作用,是目前哮喘机制的研究中相对较多的通路,其与哮喘气道炎症及气道重塑关系密切[31-33]。PPI网络拓扑分析所得的关键靶点中MMP9、TNF及IL-1β均与NF-κB信号通路有关, MMP9是气道重塑发生的关键酶, 其启动因子上含有NF-κB的结合位点[34]。

有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)是一族在真核生物中非常保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,可参与细胞的生长增殖、细胞分化、细胞运动或死亡[35]。MAPK信号通路在哺乳动物类细胞中主要由p38信号通路、ERK信号通路和JNK信号通路组成。MAPK在许多与炎症相关的细胞功能中起着重要作用,包括基因表达、细胞分化、生长和凋亡。在调节炎症介质中发挥着重要作用,该通路的激活可促进炎症细胞因子的生成而加剧炎症反应[36]。同时,NF-κB作为P38 MAPK、ERK1/2、JNK的重要下游信号因子,被激活后可诱导NF-κB活化,从而介导炎症反应。目前已有研究表明,MAPK的3个亚家族都参与哮喘的发病机理,并且在哮喘的动物模型中,3个MAPK成员的磷酸化状态/活性都被上调[37]。因此,抑制MAPK通路的活性已经成为一种用于逆转哮喘炎症和重塑的有力策略。

为了证实网络药理学预测结果,本研究选择对MAPK和NF-κB信号通路进行实验验证,结果显示黄龙止咳颗粒中的黄芪、山楂、淫羊藿等主要活性成分可能通过TNF、MAPK、NF-κB等信号通路作用于TNF、MAPK3、MMP9等关键靶点,发挥转录因子活性、酶活性、受体活性等生物学作用,从而逆转哮喘炎症以治疗哮喘。通过比较我们发现网络药理学预测与实验验证结果均证实了TNF信号通路在黄龙止咳颗粒治疗哮喘中发挥的作用,两者具有较高的一致性;同时,通过对部分拓扑分析得到的核心靶点进行qPCR实验验证发现,与网络药理学预测的结果基本一致,部分核心靶点如PTGS2、ICAM1没有表现出明显差异。

综上所述,本研究证实黄龙止咳颗粒可以改善哮喘小鼠的气道重塑和气道高反应,其机制可能是抑制TNF信号通路,从而进一步抑制MAPK和NF-κB信号通路有关,初步验证了网络药理学的分析结果,肯定了其在治疗哮喘方面的应用价值,可供临床用药参考。