红枣多糖提取工艺优化及颗粒剂的研制*

赵亚飞， 李春梅， 闵伊婷， 谢 婕

(哈尔滨商业大学药学院， 黑龙江 哈尔滨 150070)

红枣，又名大枣，是鼠李科枣属植物枣Ziziphuszizyphus.var.iuermis(Bunge)Rehd.的成熟果实，含有丰富的营养物质[1]。据文献报道，红枣水提物中主要成分为多糖类、核苷类和黄酮类3种[2-5]。除此之外还有蛋白质，氨基酸，维生素等成分。红枣多糖是红枣中一类重要活性成分，研究表明，红枣多糖具有增强免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗感染、抗氧化[6-7]、抗衰老、抗疲劳[8]、降血脂[9]、保肝和免疫调节等多种生理活性[10]。红枣是我国传统“药食同源”的一种中药，集保健和食用于一体。口感好，是一种不可多得的优良补品。中国红枣的研究，在国内和国外报道与研究均很少。本实验通过对红枣中多糖提取工艺的优化及辅料筛选，研制出红枣多糖颗粒剂，为进一步将红枣多糖作为保健食品或药品开发提供研究基础。

1 实 验

1.1 仪器与设备

CP224S型分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；电子调温加热套，天津泰斯特仪器有限公司；UV-5200PC紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；数显恒温水浴锅，常州市恒久仪器制造有限公司；电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验药品与材料

红枣：产地：新疆图木舒克市，购于人民同泰药店。

无水乙醇、丙酮、浓硫酸、5%苯酚溶液、标准葡萄糖、氢氧化钠、丙三醇、3,5-二硝基水杨酸、糖粉、糊精、淀粉、乳糖、微晶纤维素等均为分析纯。

2 内容与方法

2.1 红枣多糖的提取

红枣多糖的提取采用热水浸提法。将红枣洗净，粉碎，过40目筛，按照1:10料液比加入蒸馏水，于60 ℃条件下提取2 h，过滤，合并滤液，真空过滤，浓缩后向提取液中缓慢加入3倍体积的无水乙醇，放置过夜充分沉淀，减压抽滤，将沉淀分别以无水乙醇、丙酮反复洗涤后，真空干燥后得粗多糖粉末备用。

2.2 总糖含量的测定

粗多糖中的总糖含量测定使用苯酚-硫酸法，还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法，多糖含量等于总糖含量减去还原糖含量。苯酚-硫酸法测总糖是先用浓硫酸把原多糖断裂，再和苯酚反应显橙黄色，颜色稳定，且在490 nm处有最大吸收，测出的吸光度值与糖含量呈线性正比关系。

2.2.1 对照品溶液制备

精确称取在105 ℃温度条件下烘干至恒重的葡萄糖粉末50 mg，将其放于500 mL的容量瓶中，配成浓度为0.10 mg/mL的标准溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

取红枣粉末0.50 g，精密称定，按2.2的方法提取过滤，合并滤液，移入250 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制

将标准溶液加入不同体积的蒸馏水，分别配成浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液于六支试管中。每1 mL的标准液分别加入 5% 的苯酚溶液1 mL，并迅速加入浓硫酸5 mL，静置10 min，混匀，在30 ℃温度条件下放置30 min后于490 nm波长处测定吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标，吸光度值作为纵坐标，制作得到标准曲线。

2.3 还原糖含量测定

2.3.1 DNS显色液的制备

称取3.25 g DNS，并将其溶于少量蒸馏水，用玻璃棒搅拌溶解，之后转移至500 mL容量瓶中，依次加入体积为162.5 mL 的2 mol/L的NaOH溶液，7.5 mL的丙三醇，振荡摇匀，加蒸馏水定容至刻度，摇匀。

2.3.2 标准曲线的绘制

准确称取105 ℃温度条件下烘干至恒重的葡萄糖粉末50 mg于50 mL容量瓶中配成浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。取六支试管，向其中分别加入体积为0.00 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.30 mL，0.40 mL，0.50 mL的浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，再依次向六支试管中分别加入蒸馏水补至0.50 mL，再向每个试管中分别加入DNS试剂1.50 mL，振荡摇匀。六支试管均配制好溶液后，把它们置于沸水浴中煮沸5 min，然后取出迅速流水冷却，最后分别在每支试管中加入4 mL蒸馏水，振荡混匀。在540 nm的波长处测量吸光度值。以葡萄糖浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，作出标准曲线，得出线性回归方程。

2.4 红枣多糖含量测定

总糖含量测定：吸取1.00 mL样品液，按照2.3.3的步骤操作，计算出样品的总糖含量。

还原糖含量测定：吸取0.50 mL样品液，按照2.4.2的步骤操作，计算出样品的还原糖含量。

红枣多糖含量=总糖含量-还原糖含量。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度实验

精密吸取供试品溶液0.80 mL，补蒸馏水到1 mL，再加入 5% 苯酚溶液1 mL，并迅速加入浓硫酸5 mL，静置10 min。摇匀，30 ℃放置30 min后于490 nm测定吸光度值，重复测定6次，求RSD值。

2.5.2 稳定性实验

以上述供试品溶液做稳定性实验。供试品溶液取0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL于试管中，并标号1、2、3，用2.3的方法进行测定, 分别选取三只试管中吸光度在标准曲线范围内良好的一支试管，在60 min内，每隔10 min 测定一次其吸光度，求得RSD值。

2.5.3 重复性实验

精密吸取供试品溶液6份，每份0.80 mL，补蒸馏水到1 mL，再用2.3的方法测定吸光度值，计算RSD值。

2.6 红枣多糖的提取工艺

2.6.1 单因素实验

以料液比，温度，提取时间三因素做单因素实验，分别讨论以上三因素对多糖提取率的影响，为下文正交实验筛选出最适的研究范围。

(1)提取温度对红枣多糖提取率的影响

称取红枣10 g，采用1:10的料液比，在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃按2.3.2的提取方法分别提取2 h，选出最适提取温度范围。

(2)料液比对红枣多糖提取率的影响

称取红枣10 g，在60 ℃条件下，按料液比1:5、1:10、1:15、1:20按2.3.2的提取方法分别提取2 h，选出最佳提取的料液比范围。

(3)提取时间对红枣多糖提取率的影响

称取红枣10 g，在60 ℃条件下，采用1:10的料液比，按2.3.2提取方法分别提取1 h、2 h、3 h、4 h，选出最佳提取时间范围。

2.6.2 正交实验

以单因素实验分别选取出的三个水平，安排三水平正交实验，以多糖得率作为评价指标，选取热水提取红枣多糖的最佳条件。

2.7 红枣多糖颗粒剂的制备工艺

根据预实验筛选出淀粉和乳糖进行混合辅料配比的筛选。以原料药与辅料比为1:3，70%的乙醇作为润湿剂进行制粒。淀粉和乳糖的比例设置为1:1；1:2；2:1。以颗粒成型率和吸湿率为指标，对以上辅料进行优选。

成型率的测定：取制备的样品颗粒称重，将颗粒通过一号筛和五号筛，能够通过一号筛并且不能通过五号筛的颗粒即为成型较好的颗粒，收集这种颗粒并称重。计算颗粒成型率。公式为：

成型率=(通过一号筛而未通过五号筛颗粒重量/样品颗粒重)×100%

吸湿率的测定：将盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器放入50 ℃的烘干箱内2 h，称取样品颗粒约1.00 g，置恒重称量瓶中，干燥至恒重后精密称取重量，放于底部盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器内，并将称量瓶盖打开，放置2 h，称量重量，计算吸湿率。公式为：

吸湿率=(吸湿后的重量-吸湿前的重量)/吸湿前的重量×100%

以上述两项指标对辅料综合评分，其中成型率占50分，吸湿率占50分，选择成型率高且吸湿率低的辅料为最优辅料。

红枣多糖颗粒剂的制备采用湿法制粒的方法。将得到的粗多糖溶解，加入上述比例的辅料混合，混合均匀，至轻握成团轻压即散，用20目筛过筛使成颗粒分铺烘盘上，于60 ℃以下干燥24 h，得到红枣多糖颗粒剂。

2.8 红枣多糖颗粒剂的质量检测

根据《中国药典》(2020版)颗粒剂项下要求检查外观、粒度、水分，干燥失重和溶化性等颗粒剂项下指标。

3 结果与讨论

3.1 总糖含量测定结果

葡萄糖标准曲线如图1所示。得回归方程y =4.885x-0.0137，r=0.9998。结果表明葡萄糖在0.02～0.1 mg范围内线性关系良好。

图1 葡萄糖标准曲线

3.2 还原糖含量测定结果

DNS标准曲线如图2所示。得回归方程y =0.766x-0.0058，r=0.9998，结果表明葡萄糖浓度在0.1～0.5 mg/mL范围内线性关系良好。

图2 DNS标准曲线

3.3 方法学考察结果

3.3.1 精密度实验

[1]马少波、章力辉等：《中国京剧史》，中国戏剧出版社，北京市艺术研究所，上海艺术研究所组织编，1990年.

吸光度值见表1，求得RSD值为1.06%，吸光度稳定，说明精密度良好。

表1 精密度试验表

续表1

3.3.2 稳定性实验

吸光度值见表2。由其数据可以看出在490 nm 波长测定总糖含量时, 吸光度稳定, RSD为2.49%。说明实验的稳定性良好。

表2 稳定性试验表

3.3.3 重复性实验

吸光度值见表3，算出RSD为1.36%，吸光度稳定，说明重复性良好。

表3 重复性试验表

3.4 红枣多糖含量的测定结果

根据上文的方法，测得在60 ℃，料液比1:10，提取时间为2 h的条件下，红枣多糖含量为2.76%。

3.5 红枣多糖提取工艺结果

3.5.1 单因素实验

称取红枣10 g，采用1:10的料液比，在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃按上述提取方法分别提取2 h，结果如图3所示。

图3 提取温度对红枣多糖提取率的影响

由图3可以看出，随着水浴温度的升高，红枣多糖的提取率也不断升高，80 ℃时达到最高，超过80 ℃，多糖提取率又呈下降趋势。提取温度过高会使多糖分解，温度过低不易于多糖的浸出。因此，红枣多糖的最适提取温度范围是70～90 ℃。

(2)料液比对红枣多糖提取率的影响

称取红枣10 g，在60 ℃条件下，按料液比1:5、1:10、1:15、1:20，即稀释5倍、10倍、15倍、20倍，按上述提取方法分别提取2 h，结果如图4所示。

图4 料液比对红枣多糖提取率的影响

由图4可以看出，随着加水倍数的增加，红枣多糖的提取率也随之增加，稀释倍数为10即料液比达到1:10时，红枣多糖提取率达到最大值，最后又呈下降趋势，水量过少会使红枣粉浸泡不完全，水量过多不会显著提高提取率，可能还会使多糖水解，降低提取率。

(3)提取时间对红枣多糖提取率的影响

称取红枣10 g，在60 ℃条件下，采用1:10的料液比，按上述提取方法分别提取1 h、2 h、3 h、4 h，结果如图5所示。

图5 提取时间对红枣多糖提取率的影响

由图5可以看出，随着提取时间的增加，红枣多糖的提取率也不断升高，2 h时达到最高，超过2 h，多糖提取率又呈下降趋势。因此，提取时间过长或过短都会影响红枣多糖的提取率。提取时间短多糖没有完全提取出来，时间过长会导致多糖分解，降低提取率。

3.5.2 正交实验

在单因素实验的基础上，分别选取三个水平，正交实验的因素水平表见表4，安排三水平正交实验，做L9(34)正交表，以多糖得率作为评价指标，选取热水提取红枣多糖的最佳条件，结果见表5。

从上述试验结果和方差分析，可以看出：(1)极差R反映各因素对指标影响的大小。由于RA>RB>RC，由此可知，以上3个因素对红枣多糖提取率影响大小是：提取温度>料液比>提取时间。(2)均值K反映该因素水平对指标的影响的大小。由正交实验表得知，KA3>KA2>KA1，在提取温度这一因素下，80 ℃比其他两个水平要好；KB2>KB3>KB1，在料液比这一因素下，1:10比其他两个水平要好；KC1>KC2>KC3，在提取时间这一因素下，2 h比其他两个水平要好。综上所述，最佳提取工艺是A2B2C1，即提取温度80 ℃，料液比1:10，提取时间2 h。在此条件下红枣多糖的提取率为3.37%。

表4 因素水平表

表5 正交实验结果

工艺验证：根据正交实验筛选出的最佳工艺提取，连续提取五次，提取率分别是3.37%，3.29%，3.24%，3.33%，3.26%，RSD=1.60%，该工艺稳定可行，红枣多糖的平均提取率为3.30%。

3.6 红枣多糖颗粒剂制备工艺结果

对成型性和吸湿率综合评价，根据表6，综合评价最佳辅料配比是可溶性淀粉:乳糖=2:1。

表6 混合辅料配比的筛选

3.7 红枣多糖颗粒剂的质量检测结果

制成的红枣多糖颗粒颜色为米黄色，颗粒大小均一，颗粒饱满，干燥后颗粒疏松干燥，色泽一致，总混后颗粒颜色变浅，变白，色泽基本一致。外观、粒度、水分，干燥失重和溶化性均符合《中国药典》(2020版)颗粒剂项下的规定。

4 结 论

本实验采用水提醇沉法提取红枣中粗多糖，含量测定采用苯酚-硫酸法测总糖含量；DNS法测还原糖含量；二者相减即为多糖含量。根据正交试验选出红枣多糖的最佳提取方案为80 ℃，料液比1:10，提取时间2 h，多糖提取率为3.37%。在红枣多糖颗粒剂的辅料筛选工艺中，以成型率和吸湿率为评价指标进行综合评分，选出分数最高的两种辅料进行混合辅料制剂，再以上述指标对混合辅料配比进行筛选，筛选出淀粉和乳糖为最佳辅料进行混合辅料制粒，比例为原料药:可溶性淀粉:乳糖=1:2:1。红枣作为一种众所周知的药食同源的中药材，前景十分广阔，本课题的研究也是对中医药的现代化研究的一次探索。