番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞炎性损伤的抑制作用

吕 静， 崔宇炜， 张 英

(郑州卫生健康职业学院，河南 郑州 450005)

骨关节炎是临床常见的一种慢性关节疾病，研究显示软骨细胞凋亡是造成骨关节炎发生的重要原因之一，而微小RNA(miRNA)可调控软骨细胞增殖及凋亡等生物学过程从而参与骨关节炎发生及发展[1-3]，如何抑制软骨细胞凋亡成为了研究热点。目前临床常用的骨关节炎治疗药物(非甾体类抗炎药)存在较多副作用，天然植物化学物质具有安全、有效等优点，可为治疗骨关节炎等炎症性疾病提供新方向[4]。番茄红素可抑制氧化应激反应从而对帕金森小鼠的神经元发挥保护作用[5]，但番茄红素对软骨细胞损伤的作用机制尚未完全阐明。微小RNA-374a-5p(miR-374a-5p)表达升高可抑制新生儿缺氧缺血性脑病的神经系统炎症反应[6]，然而番茄红素是否通过miR-374a-5p影响白细胞介素(IL)-1β诱导的软骨细胞炎性损伤尚未明确。因此，本研究旨在探讨番茄红素在IL-1β刺激的软骨细胞损伤模型中的调节作用和机制。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD雄性大鼠10只，体质量180～220 g，购自南京卡文斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(宁)2016-0008。

1.2 试剂与药物 番茄红素购自晨光生物科技集团股份有限公司(纯度96%，批号20180623)。IL-1β购自上海江莱生物科技有限公司；IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)所需试剂盒购自厦门安普利生物工程有限公司；miR-374a-5p寡核苷酸模拟物(miR-374a-5pmimics)、阴性对照mimic NC序列(miR-NC)、miR-374a-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-374a-5p)、其阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物技术有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bax抗体购自美国Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 膝关节软骨细胞培养与分离 按照文献[7]报道，将10只大鼠置于75%乙醇中浸泡3 min，取出关节软骨，放入PBS溶液中洗涤4次，置于含有青霉素的小瓶中，加入Ⅱ型胶原酶溶液，剪切组织呈1 mm3碎片，置于37 ℃水浴锅内消化30 min，弃悬浮液，加入DMEM漂洗2次，弃上清，加入10倍量Ⅱ型胶原酶溶液，37 ℃水浴锅内消化30 min，收集上悬液，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀，PBS清洗并加入DMEM悬浮细胞，将分离的软骨细胞置于25 cm2培养皿进行培养。以第3代细胞为实验对象。

2.2 分组及给药 在96孔板每孔中接种100 μL对数生长期软骨细胞(密度为1×105/mL)，随机分为对照组(常规培养基)、IL-1β组(10 ng/mL IL-1β)[8]和IL-1β+番茄红素低、中、高剂量组(10 ng/mL IL-1β+2.5、5、10 μmol/L番茄红素)[9]，培养24 h。后续实验设置IL-1β+miR-NC组(10 ng/mL IL-1β+转染miR-NC)、IL-1β+miR-374a-5p组(10 ng/mL IL-1β+转染miR-374a-5pmimics)及IL-1β+番茄红素+anti-miR-NC组(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄红素+转染anti-miR-NC)、IL-1β+番茄红素+anti-miR-374a-5p组(10 ng/mL IL-1β+10 μmol/L番茄红素+转染anti-miR-374a-5p)，培养24 h。

2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 按“2.2”项下方法分组及给药，培养24 h后收集细胞及其培养液，4 ℃、3 000 r/min离心6 min，收集上清液，根据试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 按“2.2”项下方法分组及给药，培养24 h后收集细胞，4 ℃、3 000 r/min离心6 min，根据凋亡试剂盒说明书，加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，室温避光孵育20 min，通过CytoFLEX流式细胞仪分析。

2.5 RT-qPCR检测细胞中miR-374a-5p表达 将Trizol试剂添加到软骨细胞中提取总RNA，通过Nanodrop2000c光度计检测RNA浓度，使用反转录试剂盒进行cDNA制备。取2 μL cDNA，10×PCR Buffer、MgSO4、dNTPs各2.5 μL、正反向引物各0.5 μL，与RNase-Free ddH2O配制25 μL RT-qPCR扩增体系进行反应。miR-374a-5p正向5′-GACG ACTGTAGCTGATGATCG-3′，反向5′-TCCATACGATCGA CTAGCTCA-3′；内参U6正向5′-GCTTCGGCAG CACATATACT-3′，反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。采用2-ΔΔCT法计算miR-374a-5p相对表达量。

2.6 Western blot检测细胞Bcl-2、Bax蛋白表达 按“2.2”项下方法分组及给药，培养24 h后收集细胞，加入RIPA裂解液以提取总蛋白，蛋白变性后通过SDS-PAGE蛋白电泳，转膜，室温封闭2 h，分别加入一抗(1∶1 000)与内参(1∶1 000)稀释液，4 ℃孵育24 h，加入二抗稀释液(1∶2 000)，室温孵育1 h，化学发光试剂显影，采用Image J软件分析各条带灰度值。

3 结果

3.1 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞炎性反应的影响 与对照组比较，IL-1β组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)；与IL-1β组比较，IL-1β+番茄红素各剂量组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，并呈剂量依赖性，见表1。

表1 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞炎性反应的影响

3.2 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与对照组比较，IL-1β组细胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)，Bax蛋白表达升高(P<0.01)；与IL-1β组比较，IL-1β+番茄红素各剂量组细胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)，Bax蛋白表达降低(P<0.01)，并呈剂量依赖性，见图1、表2。

表2 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

图1 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表达(B)的影响

3.3 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞中miR-374a-5p表达的影响 与对照组比较，IL-1β组细胞中miR-374a-5p表达降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，IL-1β+番茄红素各剂量组细胞中miR-374a-5p表达升高(P<0.01)，并呈剂量依赖性，见表3。

表3 番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞中miR-374a-5p表达的影响

3.4miR-374a-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞炎性反应的影响 与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-374a-5p组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平降低(P<0.01)，见表4。

表4 miR-374a-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞炎性反应的影响

3.5miR-374a-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-374a-5p组细胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)，Bax蛋白表达降低(P<0.01)，见图2、表5。

图2 miR-374a-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表达(B)的影响

3.6 干扰miR-374a-5p表达逆转番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞炎性损伤的作用 与IL-1β+番茄红素+anti-miR-NC组比较，IL-1β+番茄红素+anti-miR-374a-5p组细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高(P<0.01)，细胞凋亡率升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)，Bax蛋白表达升高(P<0.01)，见图3、表6。

表6 干扰miR-374a-5p表达逆转番茄红素对IL-1β诱导软骨细胞炎性损伤的作用

图3 干扰miR-374a-5p表达逆转番茄红素对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡(A)及Bcl-2、Bax蛋白表达(B)的作用

表5 miR-374a-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

4 讨论

软骨细胞炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等均能促进骨关节炎的发生，天然药物具有抗炎、抗氧化等作用，并可以抑制软骨细胞凋亡[10-11]，但关于天然药物在骨关节炎治疗中的作用机制尚未完全阐明。

番茄红素可以通过抑制心肌细胞凋亡从而减轻心肌细胞氧化损伤[12]，还可预防神经系统性疾病的发生[13]。研究发现，番茄红素可以抑制糖尿病大鼠的氧化应激反应并改善视网膜线粒体损伤[14]。本研究中，IL-1β使软骨细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平升高，与文献[15]报道结果相似，提示模型建立成功。使用2.5、5、10 μmol/L番茄红素处理后，软骨细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平随着番茄红素剂量的增加而降低，表明番茄红素可降低IL-1β引起的软骨细胞炎症反应，且呈剂量依赖性。软骨细胞凋亡在骨关节炎的发病机制中起关键作用，通过增加Bcl-2水平及降低Bax水平有助于减轻软骨细胞的凋亡[16]。本研究中，软骨细胞在IL-1β刺激后发生凋亡，而番茄红素降低凋亡率，并上调Bcl-2表达，下调Bax表达，表明番茄红素对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡具有抑制作用，且呈剂量依赖性。

本研究结果发现，番茄红素可上调IL-1β处理的软骨细胞miR-374a-5p表达，且呈剂量依赖性，提示番茄红素保护软骨细胞损伤的作用可能与上调miR-374a-5p有关。miR-374a-5p表达上调对神经系统[17]、暴露于低氧的神经细胞损伤[18]起保护作用。本研究中，miR-374a-5p过表达可降低IL-6、TNF-α、IFN-γ水平，还可上调Bcl-2、下调Bax来抑制细胞凋亡，提示miR-374a-5p过表达可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎症反应及细胞凋亡。为探究番茄红素是否通过调控miR-374a-5p的表达而发挥作用，本研究将anti-miR-374a-5p转染至软骨细胞，分别使用IL-1β与番茄红素共同处理，结果显示IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率均升高，提示番茄红素保护软骨细胞IL-1β损伤的作用可能是通过上调miR-374a-5p来实现的。

综上所述，番茄红素可抑制IL-1β诱导的软骨细胞炎性损伤及细胞凋亡，其机制可能是通过上调miR-374a-5p的表达，可为骨关节炎的治疗提供潜在靶点。