UPLC-MS/MS法测定不同附子炮制品中14种生物碱

代 珊， 朱红梅， 李 帅， 毛九州， 张爱军*

(1.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000；2.四川省中医药科学院，四川 成都 610041)

附子是毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品，6月下旬至8月上旬采挖，除去母根、须根及泥沙，习称“泥附子”，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，但它属于毒性中药材，需经过炮制后方可入药。经典名方是指目前仍广泛应用、疗效确切、具有明显特色与优势的清代及清代以前医籍所记载的方剂[1]，2018年，国家中医药管理局发布了《古代经典名方目录(第一批)》[2-3]，其中5个经典名方中附子炮制方法记载为“炮”，如小续命汤中附子[4]，但古法费时繁琐，火候难以控制，无法适应现代工业化需求。研究表明，炒[5]、烘[6]、蒸[6]、煮[7]、煨[8]等现代炮制方法均可对附子达到减毒存效的目的。

为了解决附子现代生产工艺问题，本实验选择炒、蒸、烘、白附片和黑顺片的炮制方法，通过UPLC-MS/MS法测定其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱、乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉萨敏、多根乌头碱、宋果灵14种生物碱含量，并与古法进行比较。化学计量学是一种综合分析方法，可将多个对象与多指标相互关联，从大量复杂的数据中提取信息[9-10]，故本实验采用该方法寻找与古法相似的附子现代炮制方法，以期为该药材生产提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪、Agilent 6460型三重四极杆质谱仪、MassHunter Qualitative Analysis B.03.00软件(美国Agilent公司)；AUW220D型电子天平(日本岛津公司)；KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)；DB-207型电热恒温鼓风干燥箱(成都电烘箱厂)。

1.2 试剂与药物 乌头原碱(批号DST200807-007)、新乌头原碱(批号DST191117-026)、次乌头原碱(批号DST200807-059)、多根乌头碱(批号DST201017-059)对照品均购于成都德思特生物科技有限公司，纯度均≥98%；附子灵(批号MUST-20062606)、塔拉萨敏(批号MUST-20051801)对照品均购于成都曼思特生物科技有限公司，纯度均≥98%；尼奥灵(批号PS010183)、宋果灵(批号001150)对照品均购于成都普思生物科技有限公司，纯度均≥98%；苯甲酰乌头碱(批号111794-201705，纯度≥98%)、苯甲酰次乌头碱(批号111796-201705，纯度≥98%)、苯甲酰新乌头碱(批号111795-201805，纯度93.1%)、新乌头碱(批号110799-201608，纯度98.5%)、次乌头碱(批号110798-201609，纯度99.2%)对照品及乌头双酯型生物碱对照提取物(批号112029-201601，乌头碱纯度31.8%，次乌头碱纯度30.0%，新乌头碱纯度31.7%)均购于中国食品药品检定研究院。3批泥附子采自四川布拖，经四川省中医药科学院周先建副研究员鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，成都市科隆化学品有限公司)；其余试剂均为分析纯。

a. 对照品 b. 供试品a. reference substance b. test sample图1 各生物碱MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of various alkaloids

2 方法与结果

2.1 炮制品制备 取3批药材，每批平均分成6份，常压蒸制3 h，去皮，切片，干燥，即得蒸附子。药材用锡箔纸包裹，置于电热恒温鼓风干燥箱中，在150 ℃下烘制6～10 h至透心，去皮，切片，干燥，即得烘附子。将药材掩埋在热火灰中，炮至微裂，去皮，切片，干燥，即得炮附子[4]。将药材洗净，浸入食用胆巴的水溶液中数日，连同浸液煮至透心，捞出，水漂，纵切成约5 mm的厚片，再用水浸漂，用调色液使附片染成浓茶色，取出，蒸到出现油面、光泽后烘至半干，再晒干或继续烘干，即得黑顺片[11]。将药材洗净，浸入胆巴水溶液中数日，连同浸液煮至透心，捞出，剥去外皮，纵切成约3 mm的厚片，用水浸漂，取出，蒸透，晒干，即得白附片。将药材洗净，切片，干燥，即得生附片。将中等细度的河砂投入炒药机内，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黄棕色，断面黄色，取出，迅速筛去河砂，晾干，即得炒附片[12]。

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，甲醇制成含乌头碱8.140 8 μg/mL、新乌头碱8.115 2 μg/mL、次乌头碱7.680 0 μg/mL、苯甲酰乌头碱22.198 4 μg/mL、苯甲酰次乌头碱14.592 8 μg/mL、苯甲酰新乌头碱17.875 2 μg/mL、乌头原碱19.600 0 μg/mL、新乌头原碱20.000 0 μg/mL、次乌头原碱20.000 0 μg/mL、附子灵17.978 4 μg/mL、尼奥灵18.518 0 μg/mL、塔拉萨敏22.743 0 μg/mL、多根乌头碱18.400 0 μg/mL、宋果灵21.560 0 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材粉末(过3号筛)约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，称定质量，超声(功率300 W、频率40 kHz、水温25 ℃以下)处理30 min，放冷，混合溶液补足减失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收至干[8]，残渣用甲醇溶解于25 mL量瓶中，再精密移取1 mL至5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，滤过，续滤液用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 分析条件

2.4.1 色谱 Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相2 mmol/L醋酸铵(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(含0.1%甲酸)(B)；梯度洗脱(0～1.5 min，10%～20%B；1.5～5 min，20%～70% B；5～5.1 min，70%～100%B；5.1～8 min，100%B)；体积流量0.4 min/L；柱温35 ℃；进样量1 μL。

2.4.2 质谱 电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；毛细管电压4 000 kV；干燥气温度300 ℃，体积流量11 L/min；雾化器压力310 kPa；MRM模式扫描。各生物碱主要质谱参数见表1，MRM色谱图见图1。

表1 各生物碱主要质谱参数Tab.1 Main mass spectrometric parameters for various alkaloids

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取“2.2”项下对照品溶液适量，精密配制成不同质量浓度，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，并分别以信噪比(S/N)3∶1、10∶1为检出限、定量限，结果见表2，可知各生物碱在各自范围内线性关系良好。

表2 各生物碱线性关系Tab.2 Linear relationships of various alkaloids

2.5.2 精密度试验 将“2.2”项下对照品溶液稀释10倍，在“2.4”项色谱条件下进样测定6次，测得各生物碱峰面积RSD为0.76%～2.88%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、10、12、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得各生物碱RSD为1.81%～4.83%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一份炮制品约2 g，精密称定，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得各生物碱含量RSD均小于4.33%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取各生物碱含量已知的同一份炮制品6份，每份约1 g，按100%水平精密加入对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱、乌头原碱、新乌头原碱、次乌头原碱、附子灵、尼奥灵、塔拉萨敏、多根乌头碱、宋果灵平均加样回收率分别为102.80%、101.49%、103.33%、96.91%、102.92%、105.52%、100.37%、106.77%、96.92%、99.83%、104.19%、105.20%、105.20%、101.91%，RSD分别为3.66%、4.59%、1.08%、4.05%、3.91%、2.52%、3.31%、3.80%、1.76%、3.42%、1.05%、3.49%、2.61%、3.63%。

2.6 样品含量测定 取各炮制品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。由此可知，炮附子中生物碱总含量最高，现代炮制品中较低；蒸附子、烘附子、炒附片减毒存效作用较好；黑顺片、白附片中毒性成分虽然大大减少，但有效成分也流失较多；古法炮附子中有效成分虽然保留较多，但减毒效果较差。

表3 各生物碱含量测定结果(μg/g)Tab.3 Results of content determination of various alkaloids(μg/g)

2.7 聚类分析 采用SPSS 26.0软件，以各生物碱含量为变量进行分析，选择组间连接和平方欧式距离，结果见图2。由此可知，当平方欧氏距离为5时，6种炮制品可分为3类，白附片和黑顺片为第1类，蒸附子和烘附子为第2类，炒附片和炮附子为第3类，与炮附子最相似的是炒附片。

图2 不同炮制品聚类树状图Fig.2 Cluster dendrogram of different processed products

2.8 主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 将各生物碱含量导入SIMCA13.0.3软件中进行PCA处理，结果见图3A。由此可知，白附片、黑顺片远离炮附子，即与后者存在较大差异，但两者之间差异较小，表明不同胆巴工艺对生物碱的影响程度具有趋同性；炒附片比烘附子、蒸附子更接近炮附子，表明它对生物碱的影响程度与炮附子具有相似性。

再采用OPLS-DA模型进行分析，测得R2X=0.996，R2Y=0.841，Q2=0.657，表明模型稳定，预测能力较好。除了白附片、黑顺片外，炒、蒸、烘、炮这些炮制工艺的区分比较明显，所得成分也存在差异，见图3B。然后，以变量权重值(VIP)为指标筛选出对附子质量影响显著的生物碱，发现VIP>1者为苯甲酰次乌头碱、苯甲酰新乌头碱、附子灵、新乌头碱、多根乌头碱、次乌头碱，见图3C。

图3 各炮制品PCA-X、OPLS-DA得分图及VIPFig.3 PCA-X, OPLS-DA score plots and VIPs for different processed products

4 讨论

附子生物碱是该药材主要药效物质，其中双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱是剧毒成分，而单酯型生物碱苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱是有效成分，同时其余原碱类成分也证实具有不同程度的药理活性，如乌头原碱[13]、新乌头原碱[13]、次乌头原碱[13]、多根乌头碱[13]、塔拉萨敏[14]、尼奥灵[15]具有强心和降压作用，附子灵、宋果灵具有镇痛、降压[16]的作用。本实验发现，与古法差异较小的炮制品为炒附片，其原因可能是两者炮制温度接近，均约为170 ℃，而且炮制过程中均未有水蒸气参与；烘附子炮制温度为150 ℃，受热不均匀；蒸附子炮制温度为100 ℃，其间有水蒸气的不断参与，导致其相似度不及炒附片；白附片和黑顺片与古法差异较大，这是因为两者均经胆巴和水浸制、煮、漂、蒸等工序的处理，生物碱大量流失。但有研究发现，不同规格附子炮制品所制备复方汤剂的质量和药效存在显著差异[16-17]。

综上所述，本实验从化学成分的角度出发，发现炒附片与古法炮附子具有相似性，可为后续经典名方中该药材的炮制研究提供了理论依据。