过敏性紫癜患儿血清miR-374b表达水平及其与并发肾炎的相关性

张书锋 刘翠华 刘玉洁 江春亚 贾东华 李玉柳 刘钧菲 田 明 曹广海

肾炎是过敏性紫癜的严重并发症，发生率≥30%，严重影响预后[1]。早期、有效地评估过敏性紫癜患儿并发肾炎的情况，有利于及时采取相应治疗措施，从而改善预后。微小RNA(miR)在过敏性紫癜[2]以及紫癜性肾炎[3]的发病中起重要作用。有研究显示，IgA肾病患者外周血B淋巴细胞中miR-374b表达上调，抑制miR-374b可阻止IgA1异常糖基化，为IgA肾病的诊治提供了新思路[4]。本文报告过敏性紫癜患儿血清中miR-374b的变化情况及其与并发肾炎的关联。

1 方法

1.1 伦理学 本研究经郑州大学附属儿童医院(我院)伦理委员会审批(审批号：201801-009)。

1.2 研究设计 病例对照研究。以过敏性紫癜患儿为病例组，以健康儿童为对照组，比较两组血清中miR-374b水平；病例组分为并发和未并发肾炎亚组，分析过敏性紫癜患儿并发肾炎的影响因素。

1.3 纳入标准 病例组纳入2018年3月至2020年7月我院门诊或住院部收治的首次发病的过敏性紫癜(诊断参照文献[5] )患儿；对照组纳入同期在我院体检的健康儿童。两组均年龄≤14岁且儿童家长签署针对本研究的知情同意书。

1.4 排除标准 两组共同排除：①合并心、肝、肺等脏器疾病，原发性肾小球肾炎，风湿免疫性疾病，血液系统疾病，过敏性哮喘，系统性红斑狼疮，恶性肿瘤；②近2周内使用过糖皮质激素与免疫抑制剂；③近1个月内发生过感染性疾病。

1.5 分组考虑 病例组分为并发肾炎亚组和未并发肾炎亚组。过敏性紫癜并发肾炎的诊断参照中华医学会儿科学分会肾脏学组的“紫癜性肾炎诊治循证指南(2016)”[6]。

1.6 血清miR-374b表达水平检测 病例组患儿于收诊当天或入院次日、对照组儿童于体检当天采集晨起空腹外周静脉血各5 mL至EDTA抗凝管中，3 000 rpm离心10 min，分离血清并保存。总RNA提取(Trizol试剂盒,上海晶抗生物公司)和逆转录(One Step PrimeScript®miRNA cDNA synthesis Kit试剂盒，大连宝生物工程有限公司)均按照试剂盒说明书操作。采用实时荧光定量PCR法检测血清中的miR-374b水平，反应体系为20 μL，包含2 μL逆转录cDNA模板、10 μL的SYBR®Primer Ex TaqTMⅡ(2×)、0.8 μL的PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)、0.8 μL的Uni-miR qPCR Primer(10 μmol·L-1)、0.4 μL ROX Reference Dye(50×)和6 μL蒸馏水。正向引物序列：5'-AGTTCGGATATAATACAACCTGC-3'，反向引物序列：5'-TATCCTTGTTCTCCAGTCCTCTAC-3'。反应条件：预变性95℃ 30 s；PCR反应95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。以U6作内参，计算miR-374b表达水平。

1.7 资料截取 ①从病历资料中截取病例组患儿的性别、年龄、病程、过敏性紫癜的并发症情况，血PLT、WBC、ALB、FIB、LDL、HDL、TC，尿微量白蛋白(>2.0 mg·L-1为升高)、血IgA(>4.5 g·L-1为升高)、血IgG(>16.6 g·L-1为升高)、血IgM(>2.6 g·L-1为升高)，尿微量白蛋白采用首诊当天检查数据，其他检查数据均来自首诊和住院后首次检查记录；②从体检记录中截取对照组儿童的年龄、性别；③血清miR-374b水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0软件，计量资料以xˉ±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料以n(%)表示，两组间比较采用χ2检验。采用Logistic回归性分析法分析过敏性紫癜患儿并发肾炎的影响因素。采用ROC曲线分析血清miR-374b表达水平对过敏性紫癜患儿并发肾炎的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 病例组103例、对照组86例进入本文分析。病例组男58例，女45例；年龄3～14(7.2±1.2)岁；病程3～39(19.0±3.4)d；其中单纯性皮肤紫癜68例，伴腹痛23例，伴关节痛17例，伴消化道出血15例。对照组男46例，女40例；年龄2～13(7.0±1.1)岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义。

病例组中，并发肾炎亚组43例，未并发肾炎亚组60例。表1显示，并发肾炎亚组和未并发肾炎亚组的年龄、病程、临床表现、PLT和WBC计数、ALB、FIB、HDL、尿微量白蛋白、血IgA、血IgG和血IgM升高占比差异均有统计学意义。

2.2 miR-374b表达水平 病例组血清miR-374b表达水平(0.69±0.13)低于对照组(1.36±0.24)，差异有统计学意义(t=24.4，P<0.01)。

并发肾炎亚组血清miR-374b水平(0.51±0.09)低于未并发肾炎亚组(0.82±0.15)，差异有统计学意义(t=12.1，P<0.01)。

2.3 过敏性紫癜患儿并发肾炎的危险因素分析 以并发肾炎为因变量，以表1中差异有统计学意义的项目为自变量，行多因素Logistic回归分析，表2显示，年龄≥7岁、病程长、伴腹痛、伴关节痛、伴消化道出血、WBC高水平、PLT高水平、FIB高水平、尿微量白蛋白升高、血IgA升高、血IgG升高、血IgM升高是过敏性紫癜患儿并发肾炎的危险因素，ALB和HDL高水平、miR-374b高表达水平是其保护因素。

表1 并发肾炎亚组和未并发肾炎亚组的临床资料比较[n(%)]

表2 过敏性紫癜患儿并发肾炎危险因素的多因素Logistic回归分析

2.4 血清miR-374b表达水平对过敏性紫癜患儿并发肾炎的诊断价值 图1 ROC曲线显示，以血清miR-374b表达水平预测过敏性紫癜患儿并发肾炎的AUC为0.919(95%CI ：0.849～0.964)，截断值为≤0.65时，敏感度为90.7%(95%CI：77.9%～97.4%)，特异度为83.3%(95%CI：71.5%～91.7%)，其中真阳性39例，假阳性10例，真阴性50例，假阴性4例。

3 讨论

miR在人体多种生理病理过程中起着重要调控作用，因其在体液中比较稳定、在组织细胞中的表达具特异性、在不同物种间高度保守性以及检测较容易等，已成为临床研究关注的焦点[7，8]。miR-374b定位于染色体Xq13.2，其表达与前列腺癌等多种疾病相关[9,10]。本研究显示，过敏性紫癜患儿血清miR-374b表达水平较对照组低，与文献报道[11]一致，提示miR-374b可能参与了过敏性紫癜的发病进程。

有研究[12]报道，循环miR在肾脏炎症性疾病的发生发展中至关重要。本研究中过敏性紫癜并发肾炎患儿血清miR-374b表达水平低于未并发肾炎患儿，且多因素Logistic回归分析显示，miR-374b高表达水平是过敏性紫癜患儿并发肾炎的保护因素，提示过敏性紫癜患儿并发肾炎可能与血清miR-374b表达低水平有关。ROC曲线分析显示，血清miR-374b水平预测过敏性紫癜患儿并发肾炎的截断值为≤0.65，敏感度为90.7%，特异度为83.3%，AUC为0.919，故监测患儿血清miR-374b表达水平可能对过敏性紫癜患儿并发肾炎有一定的诊断价值。唐余燕等[13]研究显示，紫癜性肾炎患者尿液miR-374b表达水平低于体检正常人群及IgA肾病患者。有研究[14]显示，miR-374b表达水平下调可导致TNF-α介导的炎症反应增强。因此推测，过敏性紫癜患儿血清miR-374b表达水平降低，促使TNF-α等炎性因子释放增多，进而促进局部肾组织炎症反应，促使肾小球系膜细胞增殖与活化，由此参与肾炎的发生。

此外，本研究结果提示过敏性紫癜患儿年龄≥7岁、病程长、伴腹痛、伴关节痛、伴消化道出血，WBC、PLT和FIB高水平，尿微量白蛋白、血IgA、血IgG和血IgM升高是并发肾炎的危险因素；而ALB和HDL高水平是其保护因素。可能的原因为，随着年龄的增长，机体免疫能力增强，而病程越长，变态反应引发的免疫复合物沉积以及补体激活等越明显，肾小球或肾间质发生炎性反应的可能越大；伴腹痛、关节痛、消化道出血等临床特征，常提示患儿存在其他器官受累，则并发肾损害的可能性较大，与白亚杰等[15]研究结果一致。WBC可释放氧自由基、促进血管损伤，其黏附在血管内皮细胞，引发微血管损伤，增加肾损害风险；尿微量白蛋白异常可作为反映肾损害的一个敏感性指标，其含量增加常提示肾小球功能受损；PLT参与免疫应答，受多种因素的影响可趋化至肾脏，释放细胞因子等生物活性物质，引发肾损伤。肖李艳等[16]也报道，WBC升高、尿微量白蛋白异常、PLT升高是过敏性紫癜肾损害的危险因素。FIB水平升高，使机体处于高凝状态，进而引发毛细血管微血栓，导致肾损害；IgA水平升高，其形成的抗原抗体免疫复合物经由血液循环可大量沉积于小血管壁，从而引发肾损伤；T淋巴细胞与CD细胞高度表达，促进B细胞增殖，进而活化与合成IgM，与肾损伤程度密切相关。吴军等[17]研究也显示，皮疹持续时间、FIB、PLT、IgA和IgM均是过敏性紫癜患者发生肾损伤的独立危险因素。血IgG增高，提示免疫复合物沉积，可引发肾损害；ALB明显降低，提示患儿可能丢失大量蛋白，存在肾损伤的情况；HDL水平降低，运输胆固醇的作用减弱，可导致脂质沉积，进而损伤肾小管，引起肾小球硬化，与文献 报道[18-20]研究结果一致。因此，临床工作中对有以上危险因素的过敏性紫癜患儿应定期监测实验室指标，以及时发现肾炎合并症并积极干预，从而改善预后。