嘧菌酯/聚丙烯腈微球的制备及缓释性能

张钟凯, 应彩娇, 程志强, 于晓斌

(1. 吉林农业大学 植物保护学院，长春 130118；2. 吉林农业大学 资源与环境学院，长春 130118)

嘧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有渗透性强、杀菌谱广等特点，是中国目前登记条目最多的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[1]。但是，嘧菌酯传统剂型如悬浮剂(SC)、水分散粒剂 (WG) 等在兑水喷雾时会由于雾滴蒸发漂移、弹跳碎裂等因素，导致有效成分利用率低，持效期短[2-3]。农药缓控释制剂可以避免这些弊端，其中农药微球具有靶向给药、控制释放、减少用量等特点，已被广泛研究[4]。农药微球是主要依靠载体材料对农药活性成分进行调控或修饰而实现缓释功能的，因此载体材料的选择至关重要[5-6]。

聚丙烯腈 (polyacrylonitrile, PAN) 具有熔点较高、耐溶剂性等优点，是一种优良的载体材料。以PAN 为原料制备的微球具有良好的形貌，可作为靶向药物载体[7]。而目前常用的微球制备工艺如溶剂挥发法、化学交联法、喷雾干燥法等，尽管其所制备的微球粒径均一，缓释效果良好，但是存在反应条件复杂、操作难度大等问题[8-10]。

静电喷雾技术操作简单、成本低廉，用其制备的功能性微球已应用于医疗、环境保护和能源等领域[11-13]。目前国内外尚未见将静电喷雾技术应用于农业领域的研究，究其原因为静电纺丝存在着产量低的弊端，但是随着近年来静电喷雾技术的不断发展，已出现如双射流、多射流等静电喷雾方式用以提高生产效率[14]，使得这一技术有望应用在农药生产上。

本研究以PAN 为载体，采用静电喷雾技术[15]制备了嘧菌酯/PAN 微球，并讨论了工作电压对嘧菌酯/PAN 微球粒径的影响，以及嘧菌酯与PAN质量比对载药微球粒径、包封率等性能的影响，同时探究了载药微球在不同pH 条件下的缓释性能。

1 材料与方法

1.1 供试药剂、仪器及植物病原菌

97%嘧菌酯 (azoxystrobin) 原药，由苏州甫路生物科技有限公司提供；25% 嘧菌酯悬浮剂(azoxystrobin 25% SC) ，由先正达投资有限公司提供；聚丙烯腈粉末 (PAN，Mr=15000)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF，纯度99.8%)，由上海市化学试剂采购供应站提供；分析纯磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和色谱纯乙腈，购于北京化工厂；分析纯柠檬酸钠(TC)，购于天津市科密欧化学试剂开发中心；吐温80，由江苏省海安石油化工公司提供。

WL-1 静电纺丝机，由北京艾伯智业离子技术有限公司生产；SS-550 型扫描电子显微镜(SEM)，由日本岛津公司生产；1200 系列高效液相色谱仪，由安捷伦科技有限公司生产。

黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare(Berk.&Mont.) Arx，由吉林农业大学植物保护学院于黄瓜感病植株的叶片上分离得到并鉴定。

1.2 嘧菌酯/PAN 微球的制备

称取0.200 g PAN 置于样品瓶中，加入10 mL DMF，拧紧瓶盖，用恒温磁力搅拌器于50 ℃下搅拌溶解0.5 h，放入超声波清洗器中超声振荡10 min，静置，得到质量浓度为2%的PAN 溶液；然后将一定质量的嘧菌酯原药加入到上述PAN 溶液中，搅拌至溶解得到样品溶液。在40 ℃下，用5 mL注射器吸取上述样品溶液，将注射器固定在静电纺丝机的注射泵上，电场发生器正极连接注射器金属针头，搅拌器机金属杆连接负极，使整个装置形成如图1 所示的静电场[16]。设定好各种参数后，启动注射泵，在静电力和注射泵推力的作用下，液滴形成细小微球。试验结束后，收集嘧菌酯/PAN 微球备用。

图1 静电喷雾实验装置图Fig. 1 Diagram of electrostatic spray experimental device

1.3 制备条件对嘧菌酯/PAN 微球性能的影响

设定静电纺丝机工作电压分别为13、14 和15 kV，推进速率1.25 mL/h，工作距离20 cm，以DMF 为溶剂配制质量浓度2%的 PAN 溶液进行静电喷雾，得到嘧菌酯/PAN 微球[m(嘧菌酯) :m(PAN) = 2 : 1]，收集待测。

分别设定m(嘧菌酯) :m(PAN) = 1 : 2、1 : 1 和2 : 1，配制2% PAN 溶液，在推进速率1.25 mL/h、工作距离20 cm 及电压15 kV 的工艺条件下进行静电喷雾，得到嘧菌酯/PAN 微球，收集待测。

1.4 嘧菌酯/PAN 微球性能测定

1.4.1 微球形貌特征 采用扫描电子显微镜观察嘧菌酯/PAN 微球的形貌，扫描电压为5～10 kV。用Nano measurer 1.2 软件测量嘧菌酯/PAN 微球的直径。

1.4.2 包封率与载药量 称取嘧菌酯/PAN 微球30 mg，置于试管中，加入3 mL 无水乙醇，室温下浸泡、超声10 min，之后在转速6000 r/min 下离心8 min。吸取上清液，用高效液相色谱 (HPLC)外标法测定上清液中嘧菌酯的含量。

HPLC 色谱条件：Pgrandsll-STG-C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相V(乙腈) :V(水) =70 : 30，流速为1 mL/min，检测波长为245 nm，进样量为10 μL，检测器温度是25 ℃。

分别按公式 (1) 与 (2) 计算载药量(LC)与包封率(EE)[17]。

其中：ma为实际测得的载药微球中嘧菌酯的质量，mg；mt为载药微球中理论嘧菌酯的质量，mg；mb为干燥载药微球的质量，mg。

1.4.3 缓释性能研究方法 采用透析法[18]研究载药微球分别在pH 5、7 和8 的磷酸盐缓冲溶液中的释药行为。缓冲溶液的配制方法见表1。

表1 不同pH 值磷酸盐缓冲溶液的配制Table 1 Preparation of phosphate buffer solutions with different pH

试验于25 ℃下进行。称取一定质量的载药微球于透析袋 (MD 44；Mw= 7000) 中，分别在1、4 和7 h 后取3 mL 释放溶液进行分析，每次取出溶液后立即用相同体积的新鲜缓冲溶液替换，用以维持缓冲溶液的体积恒定。在与1.4.2 节相同的色谱条件下测定释放溶液中嘧菌酯的含量，并以释放时间为横坐标，累积释放量为纵坐标，得到载药微球中嘧菌酯的释放曲线。用相同的方法研究嘧菌酯原药的释放曲线。其中，药物累积释放量按(3)式计算。

其中：Qc为嘧菌酯累积释放率，% ；Cn为第n次取样时溶液中嘧菌酯的质量浓度，mg/L；Ci为第i次取样时溶液中嘧菌酯的质量浓度， mg/L；V为释放介质的总体积(300 mL)；Vm为每隔一段时间内取出的释放溶液体积(3 mL)；m为样品中总嘧菌酯含量，mg。

1.5 室内盆栽试验

根据室内试验确定25%嘧菌酯悬浮剂的最佳施药浓度为有效成分0.2 g/L，配制该浓度的药液。称取适量嘧菌酯/PAN 微球，以蒸馏水为溶剂，以质量分数为3%的吐温80 为分散剂，配制有效成分质量浓度分别为0.2、0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂，待用。

选取36 株长势相似的黄瓜幼苗移栽至塑料花盆中，分为6 组，在相同且适宜的环境条件下每天喷适量清水1 次。待移栽成活后，取适量黄瓜炭疽病菌孢子用无菌水稀释至3 × 107个孢子/mL，其中1 组黄瓜幼苗未喷孢子悬浮液 (阴性对照组) ，其余5 组均匀喷雾上述孢子悬浮液，然后置于25 ℃环境中，前12 h 黑暗保存，湿度保持在90% 以上，随后在光照与黑暗各12 h 的条件下培养，在发病初期进行以下5 个处理：清水处理 (对照组，CK ) ，有效成分0.2 g/L 的25%嘧菌酯悬浮剂，有效成分0.2、0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂，药剂处理均喷雾至药液刚好湿润叶片呈滴落状态，试验过程中每组黄瓜幼苗每天喷适量清水以保持黄瓜幼苗活性，试验重复6 次，每7 d观察1 次，共观察2 次，调查病情指数并按(4)式计算药剂防治效果[19-20]。

其中：P为防治效果，W0为对照组病情指数，Wt为药剂处理后t时刻的病情指数。

数据通过IBM SPSS Statistics 25 软件进行分析，用Duncan 新复极差法进行检验。

2 结果与讨论

2.1 静电纺丝机的工作电压对载药微球形貌与粒径的影响

采用静电喷雾技术制备载药微球时，不同工作电压下微球的形貌和粒径分布如图2 所示。由图2A～2C 看出：在3 种工作电压下载药微球在形貌上保持了良好的完整性，微球表面光滑，无明显的空洞和褶皱。由图2a～2c 可以看出：在13、14 和15 kV 工作电压下，其粒径分别为 (1.32 ±0.08)、 (1.17 ± 0.10) 和 (0.86 ± 0.08) μm，即载药微球粒径随着工作电压的增大而减小。这可能是因为当静电喷雾液的表面静电斥力增加时，对射流的拉伸作用更加剧烈，液滴被进一步拉伸导致粒径减小。

图2 工作电压分别在13、14 和15 kV 下载药微球SEM 图(A～C)和粒径分布(a～c)Fig. 2 The SEM images(A-C) and particle size distribution(a-c) of the microspheres recorded under the working voltages of 13, 14 and 15 kV

2.2 嘧菌酯与PAN 质量比对载药微球性能的影响

由表2 数据可知：嘧菌酯与PAN 的质量比对微球粒径的影响不明显，但会显著影响载药量和包封率。随着嘧菌酯与PAN 质量比的增加，载药微球载药量逐渐增大，包封率逐渐减小，这是由于嘧菌酯含量增加所致；相反，随着PAN 比例增加，PAN 对于嘧菌酯的吸附能力增强，载药微球包封率随之增大，但会导致载药量减小。由于包封率代表药物的利用情况，生产中较为重要，因此本研究选择m(嘧菌酯) :m(PAN) = 1 : 2 为最佳比例。

表2 嘧菌酯与PAN 质量比对载药微球的影响Table 2 Influence of the mass ratio of azoxystrobin and polyacrylonitrile on drug-loaded microspheres

2.3 不同pH 值缓冲溶液中嘧菌酯/PAN 微球的缓释性能

如图3 所示，嘧菌酯原药在pH 5、7 和8 的磷酸盐缓冲溶液中60 min 时嘧菌酯的累积释放量分别为80%、75%和70%，已基本完全释放，而相同条件下载药微球中的嘧菌酯由于PAN 吸附作用仅释放了18%、50%和58%；400 min 时载药微球分别释放97%、87%与69%，即在碱性溶液中释放速率更低，说明载药微球具备一定的抗酸碱能力以及良好的缓释性能。

图3 不同pH 缓冲溶液中的累积释药曲线Fig. 3 Cumulative release curve in buffer solutions with different pH

2.4 盆栽试验结果

盆栽试验结果(表3) 表明，有效成分0.3 和0.4 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂与0.2 g/L 的25%嘧菌酯悬浮剂对黄瓜炭疽病的防治效果无显著性差异。处理14 d 后25%嘧菌酯悬浮剂的防治效果相较于7 d 前下降了25.12%，而有效成分0.3 和0.4 g/L 嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂的防治效果仅仅分别下降了15.71%和12.40%，说明嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂具有缓慢释放嘧菌酯的能力；但是有效成分0.2 g/L 的嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂防效较差，可能是由于PAN 比例较高，吸附作用较强导致负载在微球上的嘧菌酯不能完全释放。从经济效益上考虑，本研究推荐嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂施用质量浓度为0.3 g/L。14 d 后各处理下黄瓜幼苗生长情况见网络版附加材料。

表3 不同剂型嘧菌酯对黄瓜炭疽病的防治效果Table 3 Control efficacy of azoxystrobin with different formulations on cucumber anthracnose

3 结论

本研究通过静电喷雾技术制备了嘧菌酯/PAN微球。在静电喷雾工作电压15 kV、工作距离20 cm、PAN 质量浓度2%、m(嘧菌酯) :m(PAN) =1 : 2 和进样速率1.25 mL/h 的工艺条件下，制备得到了嘧菌酯/PAN 微球。微球粒径为(0.89 ± 0.09) μm，包封率79.78%，载药量26.59%。缓释试验结果表明，载药微球具备抵御外界酸碱坏境的能力，能够实现嘧菌酯的长效稳定释放；室内盆栽试验表明，嘧菌酯/PAN 微球悬浮剂对黄瓜炭疽病具有长效的治疗作用，其最佳施用有效成分质量浓度为0.3 g/L。总体来说，以PAN 为载体使用静电喷雾技术可以制备出微米级的微球，并实现对嘧菌酯的负载，本研究对于嘧菌酯缓释剂型的研究具有一定的参考价值。