海南五指山猪VRTN基因的检测分析

晁 哲，邢漫萍，黄丽丽，孙瑞萍，刘海隆，王 峰

（1.海南省农业科学院畜牧兽医研究所，海南 海口 571100；2.海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海南 海口 571100）

哺乳动物的脊椎分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎共5个部分，人的脊椎数目和肋骨数目是固定的，猪、牛、羊等家畜的多脊椎和多肋骨现象比较常见[1]。猪的脊椎数变异主要发生在胸椎和腰椎，颈椎、荐椎和尾椎数目相对固定。中国地方猪种的胸腰椎总数一般为19～20根，西方商业猪种的胸腰椎总数为21～23根[2]。脊椎数是影响猪生产性能的重要因素，与其相关的性状主要有体长、胴体长、肋骨数和产肉量等。对于肉用商品猪，增加脊椎数有利于提高产肉量、扩大养殖经济效益；对于实验动物小型猪，减少脊椎数有利于降低体重体尺、提升试验操作的便利性。因此，开展猪多脊椎遗传机理研究，把脊椎数作为主要的选育指标对于我国地方猪保护与开发利用具有重要意义。

椎骨发育相关基因（vertebrate development associated, VRTN）是哺乳动物脊椎生长发育的关键基因之一[3]。猪VRTN基因位于第7号染色体上，包含2个外显子和1个内含子，在其内含子中存在一个291 bp的插入突变，该突变已被证实与猪胸椎数、胴体长、肋骨数等多个性状表型变异相关[4-5]。本研究一方面通过基因测序鉴定五指山猪VRTN基因的变异情况，另一方面通过PCR扩增检测五指山猪VRTN基因中是否存在291 bp的插入突变，为五指山猪肉用品系和实验动物品系的选育提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2021年9月15日至11月15日在海南省农业科学院畜牧兽医研究所进行。

1.2 试验材料

87头五指山猪和7头大白猪来自海南省农业科学院畜牧兽医研究所永发科研基地，采集耳组织后利用基因组提取试剂盒提取DNA，-20 ℃保存。

1.3 引物合成

根据NCBI中提供的猪VRTN基因组序列（Gene ID: 100157734），使用Primer Premier 5.0软件设计5对引物扩增五指山猪和大白猪的VRTN基因序列，通过序列比对寻找基因中的SNP位点；VRTN基因内含子中插入突变（插入片段291 bp左右）的检测引物参照Yang等[4]发表的文章，引物信息详见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PCR扩增

PCR反应体系为25 μL：其中模板DNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，灭菌去离子水9.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃变性4 min；94 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸50～90 s（由片段长度决定），共36个循环；72 ℃延伸7 min。

1.5 电泳检测

通过2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。

2 结果与分析

2.1 猪VRTN基因序列分析

使用5对特异性引物扩增猪VRTN基因后，获得5个VRTN基因扩增片段，长度分别为631、1 122、1 251、773和1 136 bp（图1），扩增片段包含VRTN基因全部外显子和部分内含子，扩增后的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。通过比对五指山猪和大白猪的VRTN基因序列，在该基因第2外显子中共发现10个单碱基突变位点（表2），其中+2 445处的A/G突变位于3′非翻译区、其它9个突变位于编码区。+1 331处的A/G突变、+1 730处的A/G突变和+1 769处的C/T突变属于错义突变，其它6个编码区的突变均是同义突变。

图1 猪VRTN基因PCR扩增片段电泳结果

表2 五指山猪与大白猪VRTN基因序列比对结果

2.2 五指山猪VRTN基因内含子291 bp插入突变检测

使用VRTN-F/VRTN-R引物扩增VRTN基因目的片段，不含291 bp插入突变的纯合子扩增条带为120 bp，含有291 bp插入突变的纯合子扩增条带为411 bp，含有291 bp插入突变的杂合子扩增条带为120 bp和411 bp。在检测的87头五指山猪中，85头不含291 bp插入突变，2头是有291 bp 插入突变的杂合子，未发现291 bp插入突变的纯合子（图2）。

图2 五指山猪VRTN基因插入突变电泳检测结果

3 讨论

五指山猪是中国特有的小型猪种，是重要的产肉动物和医学实验动物，在生产和科研上都具有重要价值[6]。五指山猪的生长发育与大白猪等现代家猪有较大差异，对照明显，且表型独特。主要表现在：①五指山猪的体型与现代家猪相反，前躯宽大（种公猪更明显），后躯较小，后腿比例（后腿重量占胴体重量的百分比）明显低于现代家猪；②五指山猪的体重轻，成年猪（按2年计算）体重50～75 kg，远低于现代家猪。③五指山猪的饲料转化率低，料重比超过5，生长发育慢于现代家猪。因此，五指山猪是研究猪生长发育机制的理想实验动物。

脊椎数目影响猪体型生长发育，属于高遗传力性状。Mikawa等[7]使用大白猪等多个猪资源群体为参考，在第1号和第7号染色体上定位到2个影响猪脊椎数目的数量性状位点（QTL, quantitative trait loci），进一步精细定位发现1号染色体上的NR6A1基因和7号染色体上的VRTN基因都是影响猪脊椎数变异的重要候选基因。由于NR6A1基因的有利等位基因在西方商业群体中经过高度人工选择已经固定，所以VRTN基因受到更多的关注[8]。随着研究的深入，猪VRTN基因内含子中的1个插入突变（插入片段291 bp左右）被发现与胸腰椎数变异相关，并逐步在中外多个猪种中得到验证[9]。在中国地方猪种中，VRTN基因内含子中291 bp插入突变比例较低，相反在大白猪、长白猪、杜洛克猪等西方商业猪种中，该位点插入突变比例很高，这与西方商业猪种的胸腰椎数目多、肋骨数多、体型较长相一致。

我们前期屠宰测定发现，五指山猪胸椎13～15个、腰椎5～6个、肋骨数为14～15根，均低于大白猪等多数中外猪种。结合本次检测结果，绝大部分五指山猪的VRTN基因内含子中都不含有291 bp插入突变，进一步验证该插入突变对脊椎数变异存在影响。从五指山猪与大白猪VRTN基因中10处突变位点的序列比较结果可以看出，大白猪VRTN基因纯合度较高，10处突变位点中有5处是单一基因型，相反，五指山猪中的这10处突变位点的基因型均呈现多态或偏态。值得注意的是，五指山猪中有3个错义突变，+1 331处的A/G突变导致天冬酰胺变为丝氨酸、+1 730处的A/G突变导致天冬氨酸变为甘氨酸、+1 769处的C/T突变导致苏氨酸变为异亮氨酸，这3个错义突变是否是五指山猪特有的还需进一步验证。

综上所述，可以通过对VRTN基因型的选择增加或减少胸椎数量，达到增加或降低体重体尺的目标，在五指山猪肉用开发或实验动物培育中，VRTN基因可以作为一种有效的分子标记，对脊椎数和体长相关性状的选育有重要的应用价值。

4 结论

五指山猪外显子中存在10处碱基突变位点，其中9个位于编码区、1个位于3′非翻译区，突变位点中有3个错义突变，分别是+1 331处的A/G突变、+1 730处的A/G突变和+1 769处的C/T突变；此外，五指山猪VRTN基因内含子中含有291 bp左右的插入突变，但频率极低。