利用HRM标记检测山东省稻瘟病菌群体的交配型分布

房文文，姜艳芳，王海凤，郭涛，薛芳，张焕霞，张士永

（山东省农业科学院湿地农业与生态研究所/山东省水稻工程技术研究中心，山东 济南 250100）

由稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病是水稻上的重要病害，危害性大、流行速度快，流行年份可造成严重减产［1］。山东省为黄淮海地区水稻主产区，以粳稻为主，年均种植面积达13万公顷。2014年临沂、日照稻区发生稻瘟病，损失严重［2，3］。目前生产上防治稻瘟病经济有效的措施是种植抗病品种［4］，但由于田间稻瘟病菌小种类型多样，易发生变异［5］，导致一些抗病水稻品种连续种植3～5年后抗性丧失，田间表现为感病［6，7］，造成减产。

高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术是一种新兴的基因分型方法，能够区分SNP、SSR及Indel等不同变异［8］。此技术无需凝胶电泳，减少了污染；PCR扩增后仅需8～10 min便可以读取96个样品数据，真正实现了快速高通量检测［9］。目前在稻瘟病菌无毒基因pex31（Avr-Pik/kp/km）检测中已有应用［10］。

有性生殖是真菌的一种生殖方式，分为同宗配合和异宗配合。同宗配合真菌通常具有一个交配型基因座，而异宗配合真菌有一对交配型基因座［11］。异宗配合真菌必须由不同交配型的菌丝细胞结合后才能产生子代。稻瘟病菌属子囊菌广大角间座壳属的异宗配合真菌，具有MAT1-1和MAT1-2两种交配型［12］，只有两个不同交配型的菌株对峙培养才能诱导产生有性态［13］。目前在自然条件下还没有发现稻瘟病菌的有性生殖，在实验室研究有性生殖较多［14］。MAT交配型基因控制稻瘟病菌等真菌的“性别”，对真菌的遗传进化起着决定性作用。研究稻瘟病菌有性态，有利于解析稻瘟病菌群体遗传多样性，并为群体变异、交配识别等提供理论基础，同时可以获得可育性菌株，为新的无毒基因的研究提供材料。

国内外有关稻瘟病菌有性生殖的研究工作已有大量报道。印度稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型［11］，美国稻瘟病菌仅存在MAT1-1交配型［15］，泰国稻瘟病菌仅存在MAT1-2交配型［16］。我国广东省稻瘟病菌交配型MAT1-2占优势［17］，宁夏稻瘟病菌都是MAT1-1交配型［14］，黑龙江省稻瘟病菌存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型，以交配型MAT1-1占优势［18］。迄今未见关于山东省稻瘟病菌株有性态研究报道。因此本研究连续5年收集山东稻区的稻瘟病菌群体，基于高分辨率熔解曲线技术测定菌株群体的交配型，明确交配型在不同稻区的分布及年份间的动态变化趋势，以期为解析稻瘟病菌有性态及遗传多样性提供依据。

1 材料与方法

1．1 试验材料

供试菌株：标准菌株S1528和P131，交配型分别为MAT1-1和MAT1-2［19］，均由中国农业大学彭友良教授课题组赠予。于2016—2020年从山东省济南、济宁、临沂、日照、滨州及东营6市水稻产区采集稻瘟病样。

供试培养基：水琼脂培养基（20 g琼脂粉溶于1 L蒸馏水，分装至三角瓶，121℃湿热灭菌20 min）；番茄燕麦培养基（30～40 g燕麦片、20 g琼脂粉、150 mL番茄汁、850 mL蒸馏水，分装至三角瓶，121℃湿热灭菌20 min）。

试剂及仪器：盐酸四环素、氨苄青霉素钠、硫磺卡那霉素、次氯酸钠溶液、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），购于生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR试剂，北京全式金生物技术（TransGen Biotech）有限公司；EvaGreen qPCR核酸染料，美国Biotium公司。血球计数板（XB-K-25），上海XB-K-25求精生化试剂仪器有限公司；Optika B-383PLi显微镜，意大利M．A．D．公司；Nikon D90相机，尼康光学仪器（中国）有限公司；SPX智能型生化培养箱、RXZ-500C-LED人工气候培养箱，宁波江南仪器厂；BCD-290W 型立式冰箱，青岛海尔股份有限公司；罗氏LightCycler®96实时荧光定量PCR仪，Roche公司。

1．2 试验方法

1．2．1 稻瘟病样本采集及病菌分离、培养 在山东省济南、济宁、临沂、日照、滨州、东营6市代表性地区和多年稻瘟病重发区采集典型稻瘟病样本。挑选单个典型病斑剪成约5 mm大小于次氯酸钠消毒2．5 min，无菌水冲洗干净后平铺至水琼脂平板上。显微镜下将分生孢子稀释至1个视野下2～3个孢子，转移至新的水琼脂平板上。待分生孢子萌发后，镜检挑取单个孢子放至番茄燕麦培养基培养，2～3 d得到单孢菌落。将单孢菌株纯化后，选菌落边缘菌丝点接至铺满滤纸片的番茄燕麦培养基上，培养5～7 d后将滤纸片揭下放入硫酸纸袋内，干燥完全后-20℃保存。将待活化菌株的滤纸片点接到番茄燕麦培养基上，28℃光照培养，5～7 d后取菌丝［20］。

1．2．2 稻瘟病菌交配型分析 采用CTAB法提取稻瘟病菌基因组DNA。参照稻瘟病菌交配型基因序列［19］设计两对引物［生工生物工程（上海）股份有限公司合成，表1］进行PCR扩增。反应体系（10μL）：2×EasyTaq®PCR SuperMix 5μL、DNA 3 μL、正反向引物各0．2μL（0．1 mmol/L）、20×Evagreen 0．125μL、ddH2O 1．475μL。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。熔解曲线分析程序为：95℃变性15 s；60℃退火15 s；以0．07℃/s的速率升温，10次/℃采集荧光信号，至90℃保持1 s。采用软件Light Cycler 96进行熔解曲线分析。

表1 稻瘟病菌交配型基因的引物序列

为了解山东省稻瘟病菌群体交配型，对不同地区间及不同年份间稻瘟病菌交配型多样性分布进行分析［18］。H＝N/（N-1）×（1-ΣXi2），式中，H为多样性指数，N为群体总菌株数，Xi为某交配型在其群体中的出现频率。采用Microsoft Excel进行数据处理。

2 结果与分析

2．1 山东省稻瘟病菌的交配型

本试验共分离到稻瘟病菌株415株（表2）。利用两对特异性引物检测稻瘟病菌交配型，对照标准菌株得到的熔解曲线，根据扩增产物双链突变位点的退火温度（Tm值）不同区分不同的基因型，结果（图1）表明，当熔解温度为78～80℃时，稻瘟病菌为MAT1-1交配型；当熔解温度为82～84℃时，稻瘟病菌为MAT1-2交配型。熔解曲线检测结果显示，山东省稻瘟病菌交配型分布不均衡：415株稻瘟病菌株中交配型为MAT1-1的菌株有12株，出现频率为2．89%；交配型为MAT1-2的菌株有329株，出现频率为79．28%；双交配型的菌株有4株，出现频率为0．96%；未检测出交配型的菌株有70株，出现频率为16．87%。

表2 本研究分离稻瘟病菌情况

橙色曲线代表MAT1-1交配型，绿色曲线代表MAT1-2交配型。

2．2 不同年份间稻瘟病菌的交配型

由表3可知，2016年供试菌株总计45株，交配型为MAT1-2的菌株有33株，出现频率为73．33%；未检测出交配型的菌株有10株，出现频率为22．22%；交配型为MAT1-1的菌株有2株，出现频率为4．44%；不存在双交配型的菌株。2017年供试菌株总计63株，交配型为MAT1-2的菌株有52株，出现频率为82．54%；交配型为MAT1-1的菌株有6株，出现频率为9．52%；未检测出交配型的菌株有5株，出现频率为7．94%；不存在双交配型的菌株。2018年供试菌株总计108株，交配型为MAT1-2的菌株有71株，出现频率为65．74%；未检测出交配型的菌株有32株，出现频率为29．63%；交配型为MAT1-1的菌株有4株，出现频率为3．70%；双交配型的菌株有1株，出现频率为0．93%。2019年供试菌株总计91株，交配型为MAT1-2的菌株有66株，出现频率为72．53%；未检测出交配型的菌株有22株，出现频率为24．18%；不存在MAT1-1的菌株；双交配型的菌株有3株，出现频率为3．30%。2020年供试菌株总计108株，交配型为MAT1-2的菌株有107株，出现频率为99．07%；未检测出交配型的菌株有1株，出现频率为0．93%；不存在交配型为MAT1-1和双交配型菌株。

2016年山东省稻瘟病菌群体交配型多样性指数为0．471，2017年为0．315，2018年为0．572，2019年为0．478，2020年为0．019。表明2018年稻瘟病菌群体多态性最高，2020年稻瘟病菌群体多态性最低。

表3 2016—2020年山东省稻瘟病菌株交配型测定结果 （株，%）

2．3 各地区稻瘟病菌的交配型

对供试菌株的交配型按照地区进行分析，结果（表4）表明，鲁北地区稻瘟病菌群体中MAT1-2、未检测出交配型、双交配型菌株的出现频率分别为87．40%、11．81%、0．79%，不存在MAT1-1交配型菌株；鲁中地区稻瘟病菌群体中MAT1-2、未检测出交配型、MAT1-1、双交配型菌株的出现频率分别为79．67%、17．07%、2．44%、0．81%；鲁南地区稻瘟病菌群体中MAT1-2、未检测出交配型、MAT1-1、双交配型菌株的出现频率分别为72．73%、20．61%、5．45%、1．21%。

对供试菌株群体交配型进行多样性指数分析，发现山东省供试稻瘟病菌群体交配型多样性指数为0．371。鲁北、鲁中及鲁南地区稻瘟病菌群体交配型多样性指数分别为0．238、0．368、0．471，表明鲁南地区稻瘟病菌群体的多态性比北部和中部地区高。

表4 山东省不同地区稻瘟病菌交配型测定结果 （株，%）

3 讨论与结论

目前常规检测交配型的方法主要是PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，该方法效率较低，难以实现批量化检测。本试验采用高分辨率熔解曲线（HRM）技术测定稻瘟病菌群体交配型，可快速、准确区分交配型基因分型，显著缩短检测所需时间，能够实现大批量稻瘟病菌交配型的快速检测。本试验方法可用于异宗配合的子囊真菌交配型的检测，有利于在丝状真菌交配型检测领域推广应用，对研究真菌遗传变异具有重大意义。

本研究发现山东省水稻种植区的稻瘟病菌群体中存在MAT1-1和MAT1-2两种交配型，且以交配型MAT1-2占优势，出现频率为79．28%，交配型MAT1-1出现频率仅为2．89%。已有研究结果［14-18］也表明，不同地区的稻瘟病菌交配型分布存在差异。在自然条件下山东省稻瘟病菌很难发生有性生殖，是否存在有性生殖还需进一步研究验证。

尽管基于PCR-HRM方法测定了山东稻瘟病菌群体的交配型，但是不能检测菌株的育性，后续将通过对峙培养检测育性，并与PCR方法检测交配型结果进行结合，从而使结论更加准确。

致谢：中国农业大学彭友良教授、赵文生教授、杨俊教授赠予标准菌株P131和S1528，特此致谢！