管理应激对奶牛泌乳性能的影响及其机制

金妍杉，刘红云

（浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058）

近年来，伴随着国民对乳制品需求量的增加和对乳品质要求的提升，我国奶业得到快速发展，但奶牛应激问题仍是制约我国奶业发展的关键因素。一般而言，应激既可指动物受到内部或外部的刺激时，机体表现出的稳态失衡状态，也可表示动物此时的防御抵抗反应，这些内部或外部的刺激被统称为应激源。奶牛应激受遗传、营养、环境和管理等多种因素影响。为缓解奶牛应激实现奶牛高产，国内外科学家及奶业从业人员在奶牛育种、营养和环境调控等方面做出诸多努力，但实际生产中因奶业区域发展水平、奶牛个体健康水平、饲料配方和饲养条件参差不齐，相关研究成果落地应用辐射面有限。相比周期长的育种技术和成本昂贵的环境控制技术，通过优化管理手段提升奶牛生产力无疑更为高效便捷。因此，越来越多研究关注管理手段对奶牛泌乳性能的影响及其机制，但相关研究成果和知识体系缺乏系统性整理和归纳。本文从奶牛应激角度归纳了主要管理手段对奶牛泌乳性能的影响及其机制，以期为现代规模化奶牛饲养提供新思路和理论依据。

1 管理因素对奶牛泌乳性能的影响

由管理因素引起的动物健康和生产水平的不良影响被称为管理应激。奶牛对管理应激敏感，管理压力超出奶牛适应能力易导致代谢紊乱、乳房炎和乳腺氧化应激等不良反应，影响奶牛泌乳性能和乳腺健康。管理应激源主要包括卫生状况、畜群密度、机械损伤、运输和护理程序改变等，其应激程度与应激源类型、持续时间及强度有关。

1.1 卫生状况 环境清洁度和牛体清洁程度息息相关，许多因素能直接或间接地影响奶牛卫生状况，例如季节和天气、棚舍设计、奶牛生理阶段、奶牛排便频率和粪便浓稠度、奶牛躺卧行为、挤奶站立时间等。牛体腹部和下肢清洁程度与乳腺内病原体感染有直接关系，导致乳腺内感染的致病菌以环境性致病菌为主，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳杆菌等，主要通过挤奶机和粪口途径传播。

不良的卫生环境常含高浓度氨气和更多致病性病原微生物。环境清洁度差可导致奶牛下肢和腹部清洁度不良、乳腺炎患病率增加，乳中体细胞数、细菌数和细菌孢子数增加。体细胞数和乳糖、乳脂、乳蛋白含量呈负相关，和乳清蛋白、血浆白蛋白、免疫球蛋白、钠钾离子等含量呈正相关。研究表明，乳中体细胞数超过100 000/mL 时乳产量开始降低，超过250 000/mL时奶牛饲料转化率降低、单日乳产量降低1.6 kg，超过500 000/mL 时乳产量进一步降低，且乳糖、乳脂和乳蛋白含量下降1%～3%。

1.2 运输过程 由于动物引种和养殖的需要，运输是奶牛养殖的必经过程之一，但运输前、中、后中的不当管理常导致经历运输的奶牛生产性能下降，严重者甚至死亡。运输时，奶牛处于高噪声、高浓度氨、不适温度、拥挤的环境中，还面临睡眠和躺卧行为剥夺、混群后等级重新分配以及昼夜节律紊乱。因此，经历运输应激的奶牛后续饲养时，容易出现被毛粗乱、精神倦怠、咀嚼减少、反刍行为减少和采食量减少等行为，免疫力低下的奶牛甚至会出现发烧、腹泻等临床症状。

运输时，奶牛血浆皮质醇水平升高，血浆白细胞、中性粒细胞和单核细胞数量增加，并渗漏至乳汁，乳中体细胞数目显著增多。近期研究对比了奶牛长途运输（200 km，4 h）前、中、后的乳产量和乳成分，运输中的奶牛乳产量会有轻微下降，乳中乳糖和非脂固形物含量显著降低，乳脂含量显著增加，而乳中的尿氮和乳蛋白含量变化无显著差异。相较于长途运输，短途运输（10.5 km，1 h）并不影响产奶量，但是乳脂含量显著提高，乳中体细胞数目成倍增长。然而，不管是长途运输还是短途运输，对奶牛而言都是一种急性应激反应，目前尚无运输应激对奶牛乳腺炎影响的报道。

1.3 挤奶程序 挤奶方式分为传统手工挤奶和自动化机械挤奶，传统手工挤奶对奶牛乳腺的影响和畜舍硬件条件、环境管理、挤奶者技术等密切相关。而自动化挤奶系统利用乳头杯挤奶，虽然乳头杯尽可能模仿犊牛吮吸的频率和压力，但由于杯内长期处于真空状态，不可避免地造成乳头机械损伤。除挤奶方式之外，挤奶频率也是挤奶流程中的重要因素。奶牛正常挤奶频率是2 次/d，低于或高于2 次/d 属于低频率挤奶或高频率挤奶。挤奶频率对产奶量或乳成分的影响和奶畜品种、哺乳阶段、生产水平和挤奶持续时间等多种因素有关。

1.3.1 挤奶方式 传统手工挤奶方式对乳产量、乳成分、乳中体细胞数和乳头健康状况等没有显著影响，但奶牛应激程度和挤奶者的技术水平息息相关。相比手工挤奶，机械挤奶的奶牛乳产量更高，乳脂、乳蛋白含量更高，挤奶持续时间更短，但奶牛应激行为更明显。自动化挤奶时，牛奶在乳头管中积聚导致乳腺静水压增大，血管和淋巴管扩张，乳池上皮可能会出血、变色和水肿，挤奶机械压力还可能导致乳头末端过度角化，增加乳腺内病原体感染风险，导致乳中体细胞数增加。温和的挤奶设备和挤奶模式可大幅度降低奶牛乳腺炎检出率和乳中体细胞数。然而，机械挤奶对乳蛋白、乳脂和非脂固形物的影响报道并不一致，可能受挤奶硬件设备、其他管理因素、奶牛遗传特征、奶牛生产阶段和畜舍环境温湿度等多方面影响。

1.3.2 挤奶频率 挤奶频率也是挤奶程序中影响泌乳性能的重要因素。低频率挤奶和不完全挤奶都会降低乳中的乳糖产量，并小幅度提升乳中体细胞数目。高挤奶频率能不断提高牛奶产量，增加乳蛋白、乳糖和非脂固形物产量，促进酪蛋白和乳清蛋白等主要乳蛋白基因表达。然而，高频挤奶条件下，乳中营养成分含量明显下降，乳铁蛋白含量降低，部分氨基酸（尤其是亮氨酸）被过度氧化，提示此时乳腺免疫功能紊乱。

1.4 其他因素 除上述因素外，畜群密度、动物混群和离群、日常护理程序变化和断奶等管理因素也会影响奶牛的生产水平。畜群密度增加意味着资源竞争更激烈，高饲养密度下的奶牛摄食时攻击行为增加、躺卧行为减少且卫生状况更差。与此同时，商业化饲养体系中奶牛的自然行为受限、奶牛混群、离群和日常护理程序变化可导致奶牛心理压力增加，进而表现出交叉吮吸和嘶鸣等异常行为。越来越多的研究表明，家畜能感知情绪，处于积极情绪中的动物生产力水平更高。

当奶牛受心理压力影响时，易引起交叉吮吸和自吮吸等异常行为，进一步导致哺乳时乳房疼痛和粘膜脆弱，更易罹患乳腺炎。与此同时，异常行为会导致奶牛能量代谢低效，用于产乳的能量和底物被分配至免疫反应，而乳房疼痛会加剧奶牛负面情绪、抑制食欲、缩减乳腺体积并降低奶牛体况评分。医学研究表明，心理压力较大的女性产后血清皮质醇浓度较高，泌乳起始时间推迟。此外，心理压力可导致女性肠道菌群和血液淋巴细胞数目改变，进而影响母乳成分和乳房健康。然而，目前鲜有研究报道心理压力对奶牛乳成分及其子代发育的影响。

2 管理应激影响奶牛乳腺泌乳性能的可能机制

管理因素导致的乳腺应激几乎都会引起乳腺上皮紧密连接损伤，进而导致乳腺结构损伤，上皮完整性变差。管理应激还可能导致乳腺易受病原体侵袭而引起乳腺内部病原微生物感染，损伤乳腺健康。另外，管理应激会引发乳腺内部氧化还原失衡，造成乳腺内部氧化应激，而奶牛乳腺可通过Nrf2-ARE、NF-B、HIF-1等多种途径响应氧化应激（图1）。

图1 管理应激对奶牛乳腺上皮细胞的影响

2.1 乳腺上皮紧密连接削弱 乳腺上皮的紧密连接主要由Occludin 和Claudin 蛋白组成，它们通过支架蛋白锚定于细胞内部肌动蛋白骨架，既发挥保护作用又发挥物质跨膜运输作用。相邻乳腺细胞间的紧密连接在泌乳起始阶段形成，完整的紧密连接对泌乳非常重要，既可以防止牛奶和血液交换离子和小分子代谢物，还起到细胞间信号传输的作用。挤奶时，奶牛乳头由于受机械刺激导致催乳素和催产素分泌。催乳素削弱乳腺紧密连接，促使乳腺上皮细胞快速从血液获取乳前体物质；催产素引起肌上皮细胞产生收缩压力，促使腺泡中的牛奶完全排出。紧密连接对催产素水平敏感，为奶牛注射超过生理剂量的催产素可导致腺泡和乳中脱落的乳腺上皮细胞增加，血浆乳糖浓度升高，而注射催产素受体的拮抗剂后，乳腺上皮细胞脱落情况改善，血浆乳糖浓度也相应降低。除了肌上皮细胞收缩压力，挤奶频率过低时牛奶积聚和挤奶时机械压力增大也可导致乳腺内部压力增大。体内外研究表明，乳腺上皮细胞最高承受3 000 pa 静水压，急性物理膨胀会改变奶牛乳腺紧密连接蛋白表达水平，下调并中断PI3K-Akt 信号通路，阻断细胞与细胞、细胞与细胞骨架间通信。有趣的是，慢性压力刺激会诱导乳腺紧密连接出现适应性反应，紧密连接的结构损伤会随着紧密连接蛋白表达和定位的稳定而逐渐恢复。总之，管理应激引起的激素分泌紊乱、机械压力增大导致乳腺内分子信号变化，紧密连接削弱，但相关机制仍待进一步探索。

2.2 乳腺感染 乳腺感染分为微生物入侵、感染和炎症3 个阶段。乳头和乳头管由于其收缩特性和末端角蛋白的生化特性，成为阻止环境微生物进入乳腺的第一道屏障。病原微生物从乳头入侵到乳池，最终到达乳腺终末腺泡。由于乳池和腺泡充满富含营养物质的牛奶，乳头括约肌收缩时即形成具有适宜温度和营养底物的封闭环境，病原微生物大量繁殖，最终引起炎症反应。奶牛乳腺炎症主要由革兰氏阴性菌和阳性菌来源的脂多糖（LPS）和磷壁酸（LTA）引起，病原体被跨膜Toll 样受体识别后，MyD88、IRAK、TRAF6 等免疫相关蛋白快速激活NF-B 和MAPK 信号触发炎症级联反应，促进免疫相关基因（如细胞因子、趋化因子、-等）转录。相关转录产物刺激乳腺释放致敏性生物活性物质白三烯、募集血液中的体细胞，其中以中性粒细胞为主的免疫细胞会释放活性氧（ROS）和蛋白水解酶，这些生化成分导致乳腺紧密连接削弱，利于体细胞进入腺泡抗炎杀菌。Zhang 等对患乳腺炎的奶牛乳腺样本进行基因组测序发现，感染24 h 后乳腺上调基因主要与免疫应答功能相关，相关通路包括ERK1/2-MLCK、NF-B、MAPK、PI3K/AKT 和NLRP3 等，下调基因主要与脂肪代谢有关，但有趣的是，乳腺内部同时激活了大量促炎反应相关通路，提示此时乳腺免疫应答紊乱。本课题组近期也利用LPS 构建了奶牛乳腺上皮细胞（Mac-T）炎症模型，研究显示NF-B 作为JAK2-STAT5 的下游信号，介导了奶牛乳腺上皮细胞对炎症的反应，并且可作为蛋氨酸二肽的分子靶点缓解炎症。总的来讲，乳腺感染通过复杂分子网络影响奶牛乳腺健康，相关营养调控物质仍待进一步发掘和应用。

2.3 乳腺内部氧化应激 氧化应激是一种乳腺内部应激，是外源性管理应激在分子层面的具体表现。乳腺应激时面临较强的代谢负荷，导致ROS 水平大幅度升高，超过细胞的抗氧化能力，乳腺氧化还原平衡被打破进而产生氧化应激。较高水平的ROS 往往导致细胞中蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能受损。实际上，ROS等自由基导致的稳态失衡是一种由“氧化应激”“炎症反应”“免疫功能失衡”三方面因素叠加的联动效应。

2.3.1 乳腺氧化还原失衡 目前没有直接证据证明环境清洁度和氧化应激间的关系，但环境清洁度差和乳腺炎患病率有直接联系。相较正常乳，乳腺炎乳中丙二醛（MDA）水平显著升高，过氧化氢酶活性和总抗氧化能力显著降低。近期研究也提示，局部和全身炎症可能与乳腺氧化应激有密切联系，而氧化应激进一步刺激炎症并导致免疫功能紊乱。经历运输应激的奶牛血清ROS、MDA 和谷胱甘肽过氧化物酶水平显著增加。此现象在犊牛上更加严重，运输2 h 后犊牛血清皮质醇水平显著升高，肿瘤坏死因子（TNF-）和白介素17（IL-17）水平显著提升。对挤奶方式和频率而言，自动挤奶系统会导致奶牛血浆活性氧代谢水平较高，并在泌乳盛期达到最高，这可能是由于奶牛乳腺泌乳盛期代谢最活跃，更易产生氧化应激。已往研究表明，初产奶牛对挤奶频率的变化比经产奶牛更敏感，较高挤奶频率可导致尾静脉多形核中性粒细胞氧化水平显著升高，氧化水平上升幅度约为经产奶牛的1 倍，并随着产犊时间临近逐渐增加。由此可见，管理应激普遍会引发乳腺内部氧化还原失衡，给奶牛乳腺健康造成威胁，但目前相关研究多集中于表型探索阶段。

2.3.2 氧化应激的分子机制

2.3.2.1 Nrf2-ARE 途径 氧化应激可通过Nrf2-ARE 信号通路影响奶牛乳腺健康。正常生理状况下Nrf2 蛋白被Keap1 蛋白限制在胞浆内，而氧化应激时ROS 与Keap1 蛋白IVR 结构域上的半胱氨酸残基反应，引起Keap1 蛋白构象改变，Nrf2 蛋白被释放并转位至细胞核中，触发下游抗氧化、生物转化与解毒相关基因转录。本课题组利用过氧化氢诱导奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）氧化应激，发现Nrf2-ARE 信号通路是调节BMECs 氧化应激的关键通路，并可作为抗氧化饲用添加剂白藜芦醇的分子靶点。近期研究利用LPS 在野生小鼠和敲除小鼠上构建乳腺炎模型，结果显示敲除基因的小鼠相较野生型小鼠抗氧化能力更弱，线粒体相关凋亡水平和内质网应激水平较高。此外，姜黄素、槲皮素、香豆素、肉桂酸、胡椒碱、儿茶酚胺等天然产物也被发现可靶向Nrf2 信号通路，缓解不同组织器官的氧化应激，但相关研究多集中于小鼠等模式动物，靶向Nrf2 信号通路缓解奶牛乳腺氧化应激的天然产物仍待发掘。

2.3.2.2 NF-B 途径 NF-B 信号通路主要可分为经典和非经典途径，二者均可被氧化应激激活。经典途径通过IKK-和IkBa 磷酸化和泛素化降解，诱导NF-B 转位至核中激活下游基因的转录。而非经典途径主要通过IKKa 诱导NF-B2/p100 前体的蛋白酶解以激活NFB2/RelB，下游基因主要和免疫功能相关。NF-B 的激活受到细胞内氧化还原系统的调节。研究显示，人类T 细胞中的NF-B 信号通路可被微摩尔浓度的过氧化氢激活，并且该激活受到抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的阻断。随着分子技术不断发展，NF-B 信号已被证明可介导甲萘酮、棕榈酸、-羟基丁酸、一氧化氮等引起的细胞氧化应激反应，使用抗氧化剂处理后NF-B、ERK1/2、Akt 信号均下调。NF-B 信号下调还可改变紧密连接蛋白表达，进而维持氧化应激时乳腺上皮血乳屏障的完整性，提示NF-B 信号下调或可部分逆转氧化应激带来的泌乳性能下降。总的来讲，NF-B信号可响应乳腺上皮氧化应激，但和泌乳相关的研究鲜有报道，靶向NF-B 信号的泌乳调控物质有待开发。

2.3.2.3 HIF-1 途径 氧化应激还会激活主要由HIF-1 蛋白介导的低氧响应信号通路，该通路对细胞内氧水平敏感。HIF-1 是一种由HIF-1和HIF-1组成的异源二聚体蛋白，其活性主要由HIF-1的活性决定。常氧条件下，HIF-1被脯氨酸羟化酶结构域蛋白(Prolyl Hydroxylase Domain Protein，PHDs)羟基化，其活性受抑制并被蛋白酶体泛素化降解。缺氧条件下HIF-1结构稳定并转位至细胞核与HIF-1结合，进一步调控下游基因转录。ROS 一方面可通过二硫键使PHDs 形成失活的二聚体，导致HIF-1无法羟化和降解，进而转位至细胞核中；另一方面也可作为信号传递分子参与低氧响应，胞浆中的ROS 可通过触发PI3K 信号稳定HIF-1。此外，PHDs 催化活性受氧化还原系统的影响，亚铁离子和抗坏血酸等物质可维持PHDs 催化活性稳定。氧化应激时，谷胱甘肽和抗坏血酸水平降低，ROS 水平升高，亚铁离子不能维持其还原状态，进一步导致PHDs 催化活性下降，对HIF-1的羟化作用减弱。此外，氧化应激还会导致乳酸积聚，在乳酸脱氢酶B (LDHB)的催化下，乳酸被转化为丙酮酸。而丙酮酸可竞争PHDs的酶活性位点，致使其催化功能受抑制。已有研究证明HIF-1 信号通路是天然植物抗氧化添加剂白藜芦醇、姜黄素的分子靶标。虽然这二者都曾被用于抵抗动物器官氧化应激，但靶向HIF-1 信号通路的泌乳调控物质仍有待发掘和应用。

2.3.2.4 其他途径 除上述途径外，PI3K/Akt、MAPK、AMPK 等途径也被报道可响应动物不同组织不同程度的氧化应激。研究显示，PI3K/Akt 是Nrf2-ARE 途径的上游信号，在体外氧化应激细胞模型和阿尔兹海默症小鼠模型中，抑制PI3K/Akt 信号激活导致Nrf2-ARE 信号通路无法正确激活，细胞抗氧化系统无法响应氧化应激。此外，PI3K/Akt/mTOR 信号介导的细胞自噬在氧化应激损伤修复中也有重要作用。本课题组近期研究显示，MAPK 信号通路在小鼠乳腺上皮细胞氧化应激模型中被激活，不同抗氧化剂处理后信号激活水平显著降低（未发表）。AMPK 信号由于和能量代谢紧密相关，在一些慢性代谢疾病引起的氧化应激中发挥关键作用，例如AMPK 信号激活可缓解糖尿病和长期高脂饮食导致的器官氧化应激损伤，其背后机制可能涉及AMPK 信号介导的自噬和凋亡等过程。

3 小 结

饲养管理在奶牛各个生产阶段都必不可少，其效果受多方面因素影响。不科学的饲养管理方式常导致奶牛发生应激，影响奶牛乳腺健康和泌乳性能，缩短奶畜使用年限，引起较大经济损失。环境清洁度差、长途运输、机械挤奶和高频率挤奶等管理因素可导致乳腺上皮紧密连接受损，乳腺血乳屏障脆弱，进而降低泌乳性能和乳腺防御功能，使乳腺更易暴露于环境致病菌引起的炎症和乳腺内部氧化应激。Nrf2-ARE、NF-B 和HIF-1 是乳腺响应氧化应激的主要通路，且是许多天然生物活性物质的分子靶点，但在奶牛乳腺中的相关研究较少。未来研究应进一步探索不同饲养系统下管理因素对奶牛乳腺健康和乳成分的影响，规范奶牛管理方法，明晰管理应激引起奶牛乳腺内部氧化应激的分子机制，开发靶向性抗应激饲用添加剂，为奶牛乳腺健康和泌乳营养调控提供新思路。