肾虚质、脾虚质大鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表达差异性研究*

孙瑜嬬，孙理军，王梓安，史鹏云

陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

中医学中脾与肾的功能不仅包括解剖学的脾肾两脏，还包括神经、内分泌、免疫等多个系统，与机体生长发育、衰老、消化吸收、气血生成及津液输布密切相关[1-2]。水谷是五液生成的物质基础，依赖脾胃的运化、转输注于脏腑，最后归藏于肾中。脾肾两脏均参与了水液的运行输布，其津液沿脾肾两经脉上乘达口腔，形成涎唾。《素问·宣明五气》曰：“五脏化液……脾为涎，肾为唾。”脾开窍于口，主运化水谷精微，能够促进食物的消化、吸收，并且将营养物质输布与传送。脾为涎，唾液的生成源于脾运化的水谷精微，而唾液又能促进脾的运化功能。肾者水脏，主津液，肾脏化生唾液，使其源源而上，充于口中不至溢于口外，主要是依赖肾阳的温煦、气化及收纳、封藏功能来实现的。

涎和唾均为口腔分泌物，是由舌下腺、腮腺、下颌腺等唾液腺共同分泌的液体，临床实际中很难将其区分开，故又合称为口水、唾液等[3]。本文通过制备肾虚体质与脾虚体质动物模型，研究不同体质状态下唾液细胞因子的变化，探讨肾虚体质和脾虚体质对唾液腺功能的影响。

1 材料

1.1 动物8周龄SPF级SD大鼠，雌鼠15只，雄鼠5只，体质量180～220 g，购买于西安第四军医大学实验动物研究中心，合格证号：SCXK(陕)2018-003。室温20～26 ℃，标准饲料喂养，自由饮水进食。成熟土猫1只，凶狠善叫，前期猫粮喂养，造模期间以猫粮并不定期投入实验淘汰掉的子代鼠喂养。

1.2 药物与试剂匹鲁卡品(山东博士伦福瑞达制药有限公司生产，国药准字：H19983028)。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，货号：EK0526、EK0374、EK0418)；生理盐水(西安京西双鹤药业有限公司，批号：172703)。

1.3 仪器FT-200型小动物跑步机(成都泰盟软件有限公司)；HJT-B型天平(华杰电子有限公司)；CB880V型洁净工作台[苏洁医疗器械(苏州)有限公司]；PHS-2C 型pH计(上海康仪仪器有限公司)；DY89-1型匀浆机(宁波新芝生物科技有限公司)；DHP-9052型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Elx808IU型酶标仪(美国Biotek公司)；CR22GⅡ型低温离心机(离心半径：13.5 cm，日本日立公司)。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备20只SD大鼠常规饲养1周后，按雌雄比例3：1进行合笼交配。待雌鼠成功受孕后，将15只孕母鼠随机分为A、B、C三组(n=5)。A组孕鼠每日800—2000置于特质鼠笼，将鼠笼固定于内有凶狠土猫的大笼内，孕鼠与土猫间仅有一层铁丝网相隔，猫爪能够触碰孕鼠但不能将之捕获，使A组孕鼠处于恐吓状态直至先天不足的仔鼠出生。B、C组孕鼠不做任何刺激。非恐吓时间A、B、C三组孕鼠均置于相同环境下确保其他非处理因素一致，直至三组孕鼠产下仔鼠。A组仔鼠正常喂养4周后随机选取10只，雌雄各半，继续上述“猫吓鼠”恐吓方案，并不定期投入实验淘汰掉的仔鼠喂养土猫，使仔鼠在旁观看强化恐吓刺激，持续4周，所得仔鼠即为“先天不足+后天失养肾虚质”型小鼠[4-8]，记为肾虚质组。B组仔鼠正常喂养4周后随机选取10只，雌雄各半，不规律喂食使其饥饱无度，并于每日800将其放置在小动物跑步机上跑步30 min，速度10 m·min-1，不设坡度，六个跑道后方均装有电击装置，仔鼠若触碰则会遭受电击。为避免电击惩罚，仔鼠将持续向前奔跑直至精疲力竭。以仔鼠出现跑步吃力、半卧位姿势跑步、降低跑道转速度后仍无法恢复跑动能力，停止运动后出现气促、神倦，且对外界刺激不敏感为力竭标准。4周后所得仔鼠即为“饮食不节+劳倦过度复合型脾虚质”模型小鼠[9-10]，记为脾虚质组。C组仔鼠随机选取10只，雌雄各半，标准饲料喂养，自由饮水进食8周，记为平和质组。

2.2 各组仔鼠一般情况检测分别在仔鼠6周龄和8周龄时称其质量，并观察各组仔鼠的神态、活动能力、饮食、毛色等变化。

2.3 各组仔鼠唾液pH值检测造模结束后，各组仔鼠禁食12 h后称其质量，以10 mL·kg-1剂量腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛进行麻醉[11]，麻醉后腹腔注射0.2% 匹鲁卡品(7.5 mg·kg-1)促进唾液分泌[12]，于仔鼠麻醉状态下收集口腔唾液；将收集的唾液3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，进行唾液pH值检测。

2.4 唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表达检测处死动物后摘取唾液腺，放入加有生理盐水的离心管中并置于冰上进行组织匀浆，防止高温破坏活性。组织匀浆液以3 000 r·min-1离心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存。TNF-α、IFN-γ、IL-10采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)进行检测。将试剂盒取出后复温 30 min，设标准孔和样本孔，每孔设1个复孔，依次滴加标准品和稀释的待测样本各100 μL，37 ℃密封孵育90 min；反应后弃液体并吸干多余水分；除空白孔外，每孔滴加抗体工作液100 μL，37 ℃密封孵育60 min；洗涤液清洗3次，每次1 min；除空白孔外，每孔滴加ABC Diluent Buffer 100 μL，37 ℃反应30 min，洗涤液清洗5次，每次1 min；每孔滴加显色液90 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔滴加终止液100 μL，15 min内采用酶标仪于450 nm波长处检测OD值。

3 结果

3.1 各组仔鼠一般生长情况比较平和质组仔鼠饮食正常，体格健硕，体质量增长迅速，精神良好，活动度高，毛发密实有光泽，二便正常。肾虚质组小鼠在造模过程中出现孕鼠成群蜷缩在笼子角落，瑟缩易惊、大小便增多、摄食量减少、产子量明显减少的现象，仔鼠体格瘦小，蜷卧少动，皮毛松弛，毛发稀疏灰暗、光泽度差。脾虚质组仔鼠随着造模进行出现饮食逐渐减少，形态消瘦、体质量增长缓慢、精神萎靡不振、大便增多等现象。仔鼠第6、8周体质量对比发现，与平和质组比较，肾虚质组仔鼠第8周体质量及两周内体质量增长显著降低(P<0.01)，脾虚质组第6、8周体质量及两周内体质量增长均显著降低(P<0.01)；与肾虚质组比较，脾虚质组第6、8周时仔鼠体质量及两周内体质量增长均显著降低(P<0.01)。见表1。

3.2 各组仔鼠唾液pH值比较与平和质组比较，肾虚质组、脾虚质组小鼠唾液pH值显著升高(P<0.01)；与肾虚质组比较，脾虚质组小鼠唾液pH值无明显变化。见表2。

表2 各组仔鼠唾液pH值比较

3.3 各组仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比较与平和质组比较，肾虚质组小鼠唾液腺中IFN-γ、IL-10的含量显著降低(P<0.01)，TNF-α含量无明显变化；脾虚质组小鼠唾液腺中TNF-α含量显著升高(P<0.05)，IFN-γ和IL-10含量显著降低(P<0.01)；与肾虚质组比较，脾虚质组小鼠唾液腺中TNF-α、IFN-γ、IL-10含量无明显变化。见表3。

表3 各组仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比较

表3 各组仔鼠唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10含量比较

组别nTNF-αIFN-γIL-10平和质组10180.62±24.9153.54±8.2728.74±2.21肾虚质组10196.34±20.4239.26±7.72∗∗25.24±2.43∗脾虚质组10201.99±11.71∗42.85±5.86∗∗23.57±3.99∗∗

注：与平和质组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

“唾”与“涎”是中医“五液”中的重要概念，二者无论是生成、与脏腑的关系或是病理变化等都有区别，但同属口腔分泌物，临床实际中很难将二者截然区分，因此合称为唾液、唾沫。《灵枢·九针论》言：“五液：心主汗、肝主泣、肺主涕、肾主唾、脾主涎，此五液所出也”，明确提出脾肾与涎唾密切相关。《说文解字》又言：“唾，口液也”“涎，慕欲口水也”。《辞海》云：“唾为口液”“涎即唾液。”《辞源》曰：“唾为唾沫”“涎为口液”。唾液与脾肾密切相关[13-17]，脾肾两脏均参与了水液的运行输布，使津液沿脾肾两经脉上乘达口腔，形成涎唾。足太阴脾经起于足大趾，上行挟咽，连于舌本，散于舌下。廉泉，也为脾脉所系，涎为上出于廉泉之液。肾所藏之津，经足少阴肾经循行，起于足小趾，上行沿喉咙至舌根，自廉泉出于舌之端形成唾。从现代医学来看，唾液腺的解剖位置(第二磨牙附近、口腔底部及舌系带两旁的口腔黏膜)正是脾肾两经脉的循行范围。所以，唾液的分泌受脾肾两经的控制，脾肾两脏功能的盛衰，直接影响唾液分泌量的多寡。

脾开窍于口，主运化水谷精微，能够促进饮食的消化、吸收，并且将营养物质输布与传送。脾之健运，则食物摄纳正常，口腔分泌的唾液不仅可以润泽食物，而且可对食物进行初步的消化。脾主运化水湿，唾液化源于脾，又受脾的制约，通过脾阳的气化与固摄，口中的涎液既不会因为涎液过多溢于口外，也不至于干涸少涎而引起口燥咽干的不适。肾为水脏，唾为精汁，肾脏化生唾液，使其源源而上，充于口中不至溢于口外。肾气充足，蒸腾气化津液，唾液不断泌泄，则口腔润泽。若肾气不足，温煦、摄纳失藏，则唾液泌泄失常，可能出现多唾、久唾或少唾、无唾的病证。肾为先天之本，脾为后天气血生化之源，脾肾两脏共同调节着津液在体内的运行输布。“脾阳根于肾阳”，脾之健运，运化水谷精微的功能依赖肾阳的温煦；但肾中精气的充足与否则依赖脾运化的水谷精微的充养。所以，唾液的分泌，受脾肾两脏相互资助，共同发挥其生理功能。

以肾中精气亏损、脏腑功能低下为主要特征的肾虚质和以脾气亏虚、脾胃功能低下的脾虚质同属病理体质[18]，研究不同病理体质下，唾液pH值、唾液腺TNF-α、IFN-γ、IL-10表达水平的差异，是本实验的重点。研究结果发现，与平和质组比较，肾虚质、脾虚质大鼠体质量和净增长均显著降低，唾液pH值显著升高，提示病理体质大鼠的生长发育低于正常大鼠，唾液腺性状和功能已发生明显改变。由于肾虚质时，肾精亏虚，导致脾不健运、唾液分泌异常；脾虚质脾胃功能衰退，枢机不利，气血生化无源，不能充养四肢，直接导致肌肉瘦削，故脾虚质模型大鼠体型更小、体质量更低，提示脾虚质对体质量的影响较肾虚质更主要、更直接。

细胞因子是多种细胞所分泌的低分子量可溶性蛋白质，属于生物信息分子，具有调节免疫功能，参与炎症发生、创伤愈合，并刺激细胞活化、增殖和分化等。对唾液腺中TNF-α、IFN-γ、IL-10的表达水平检测发现，与平和质组比较，肾虚质、脾虚质组IFN-γ和IL-10含量降低，且脾虚质组TNF-α含量升高。TNF-α为炎性因子，主要由T细胞等免疫细胞产生，在细胞增殖、分化及凋亡等方面发挥重要作用，并参与肝癌在内的多种肿瘤疾病的发生和发展，激活中性粒细胞和淋巴细胞，调节机体的免疫功能，维持机体内部的稳定，防止众多致病因子对机体的侵害，是不可或缺的免疫调节因子[19-20]。本研究中，脾虚质TNF-α含量升高，提示免疫平衡出现失调，体内释放的大量TNF-α与其它炎症因子共同作用，造成病理损伤出现。IFN-γ能激活巨噬细胞和B淋巴细胞，增强抗原递呈作用，促进多种细胞因子的分泌，具有抗病毒、抗肿瘤作用，可增强机体免疫调节功能，通过增强Th1细胞的活性而增强细胞免疫；还可通过抑制Th2的细胞增殖而抑制体液免疫，即可通过不同途径、不同机制发挥抗病毒和免疫调节作用[21-22]。肾虚质组、脾虚质组IFN-γ含量降低，提示在肾虚、脾虚的病理体质下，机体免疫失衡，免疫功能降低。IL-10是公认的抗炎因子，是免疫过程中重要的负调节因子，主要来源于活化的T细胞和巨噬细胞，具有很强的抗炎和免疫抑制活性，能抑制促炎因子的释放和抗原的递呈，下调单核细胞、巨噬细胞分泌TNF-α、IFN-γ等，直接或间接抑制炎症反应[23-24]。肾虚质、脾虚质组 IL-10 含量降低，脾虚质组TNF-α含量升高，提示抗炎反应与促炎反应失衡，模型动物免疫稳态遭到破坏，但肾虚质、脾虚质组间比较，上述指标差异无统计学意义。

综上所述，两种模型的造模方法可见相应体质所应有的症状表现，肾虚体质与脾虚体质较平和质组出现免疫稳态失衡，但肾虚体质与脾虚体质组间比较，所观测指标上并没有显著性差异，进一步阐述了中医“脾在液为涎”“肾在液为唾”理论的内涵，涎唾分泌于口，为脾肾共同所主。