少见诺卡菌MALDI-TOF MS鉴定结果及临床感染特点分析*

范 宁，谢立民，段雪红△，鱼丽萍，朱 琳

陕西省咸阳市第一人民医院：1.检验科；2.神经内科；3.药学室，陕西咸阳 712000

诺卡菌是一类需氧放线菌，革兰染色为细长丝状、分枝明显的阳性杆菌，抗酸染色弱阳性，易引起免疫功能低下人群感染。诺卡菌培养和鉴定比较困难，临床分离率低。随着分子生物学技术和质谱技术的应用，其临床分离率逐渐升高，国内诺卡菌感染病例报道数量呈上升趋势[1-4]，但由于诺卡菌感染患者的临床表现无特异性，易被误诊为其他疾病，如结核病、真菌感染、肿瘤等，从而延误了疾病治疗的最佳时机，甚至导致死亡[1]。现对本院2019年6月至2021年6月分离的诺卡菌的鉴定结果及临床感染特点进行分析。

1 材料与方法

1.1菌株来源 将本院2019年6月至2021年6月来源于11例患者的12株诺卡菌作为回顾性研究样本，剔除同一患者相同部位重复菌株。校准菌株大肠埃希菌ATCC 8739，质控菌株皮疽诺卡菌ATCC 3308。

1.2仪器与试剂 VITEK MS全自动快速微生物质谱检测系统(法国生物梅里埃公司)、16S rRNA基因测序仪[赛音生物技术(上海)有限公司]、哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图公司)。

1.3方法 将从11例患者分离到的可疑菌株利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定，同时与16S rRNA基因测序结果对照；对其中7株菌进行肉汤稀释法药敏试验；收集确诊患者的临床资料及实验室检查结果。(1)质谱鉴定。选择24～72 h疑似菌落利用VITEK MS质谱检测系统进行鉴定，未嵌入培养基生长的菌落按一般细菌鉴定流程操作，嵌入培养基生长的菌落按“分枝杆菌、诺卡菌流程”鉴定。所有菌株均涂两个点位。(2)基因测序。将菌株送赛音生物技术(上海)有限公司进行16S rRNA基因测序。

2 结 果

2.1临床资料 11例患者中男5例、女6例，年龄48～80岁、平均(64.9±11.1)岁。64%(7/11)的患者有1种及以上基础疾病，以高血压、冠心病、支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和糖尿病为主。2例患者放弃治疗，其中患者1有肝炎、糖尿病和COPD等基础疾病，患者9合并支气管扩张症和肺癌。2例无基础疾病者未使用抗菌药物，病情好转。共送检标本12份，其中呼吸道标本9份(75%，9/12)，包括痰和肺泡灌洗液各4份及1份鼻腔分泌物。见表1。

表1 11例诺卡菌感染病例临床特点

2.2实验室检查数据 64%的患者白细胞计数升高，36%的患者中性粒细胞比例升高，70%的患者C反应蛋白、超敏C反应蛋白水平升高，75%的患者降钙素原水平升高。见表2。

表2 11例诺卡菌感染病例实验室检查结果

2.3病原菌培养及鉴定

2.3.1显微镜检查 诺卡菌革兰染色镜下典型形态为成簇的细长丝状、分枝明显的阳性杆菌，见图1；弱抗酸染色可见红色细长丝状菌体，见图2。

图1 革兰染色形态(×1 000)

图2 弱抗酸染色形态(×1 000)

2.3.2菌落形态 哥伦比亚血琼脂平板置于5%CO2培养箱35 ℃培养2～7 d或者更长时间，可见微黄色或白色、干燥菌落(图3)或表面褶皱/堆积卷曲、嵌入平板生长的菌落(图4)。由于菌种不同，菌落形态之间存在差异。

图3 哥伦比亚血平板干燥菌落(3 d)

图4 哥伦比亚血平板嵌入生长菌落(5 d)

2.3.3菌种鉴定 经基因测序，12株诺卡菌全部鉴定到种，VITEK MS质谱检测系统鉴定到种为10株(83.3%)，未鉴定到种的包括1株天美诺卡菌(错误鉴定为亚洲诺卡菌)和1株豚鼠耳炎诺卡菌(无鉴定值)。见表3。

表3 VITEK MS质谱鉴定与16S rRNA基因测序结果

2.4药敏试验 对其中7株诺卡菌进行肉汤稀释法药敏试验，结果显示，7株诺卡菌对利奈唑胺、妥布霉素和阿米卡星全部敏感，对复方磺胺甲噁唑的敏感率为71.43%(5/7)，对阿莫西林/克拉维酸和喹诺酮类药物全部耐药。对头孢曲松和亚胺培南敏感率均为57.14%(4/7)。7株诺卡菌肉汤稀释法药敏试验最低抑菌浓度(MIC)结果见表4。

表4 7株诺卡菌肉汤稀释法药敏试验MIC结果(μg/mL)

2.5治疗与转归 11例患者中2例放弃治疗；5例应用了复方磺胺甲噁唑，好转出院；1例使用甲硝唑/头孢西丁，好转出院；1例使用美罗培南/米诺环素，症状缓解；2例未使用抗菌药物。

3 讨 论

诺卡菌生长缓慢，生化反应不活泼，菌种鉴定效果不佳[5]，对其鉴定到种水平通常难度较大。传统的生化鉴定方法不仅费时费力，而且随着菌种分类的不断增多，鉴定到种水平受到了很大程度限制。近年来，MALDI-TOF MS技术由于其快速、准确、灵敏、自动化及高通量等特点，在微生物鉴定中的应用发展迅猛[6]。本研究利用VITEK MS系统鉴定诺卡菌，与16S rRNA基因测序结果基本一致，种鉴定率为83.3%(10/12)，由于天美诺卡菌在VITEK MS IVD V3.2版本数据库中缺乏相关数据，被错误鉴定为亚洲诺卡菌，豚鼠耳炎诺卡菌由于菌落噬琼脂生长严重，提取蛋白时存在琼脂干扰，导致质谱图谱分辨率降低而无法鉴定。陈莹等[5]与王鹏等[6]报道利用MALDI-TOF MS技术可对85.1%和84.8%的诺卡菌鉴定到种，与本研究结果接近。美国的一项研究结果略低(76%)[7]。德国研究者则在质谱鉴定时经甲酸和乙腈处理后，种鉴定率从74.4%提高到89.7%[8]。诺卡菌分类和鉴定比较复杂，虽然MALDI-TOF MS技术可以将最常见的诺卡菌准确鉴定至种或复合物水平，但其局限性是系统数据库不完善，对于不常见菌种，仍需通过基因测序鉴定。由于16S rRNA基因测序技术复杂且难以常规开展，CONVILLE等[9]建议使用更多的MALDI-TOF MS系统，作为第1步鉴定方法，验证最常见的诺卡菌种，以减少需要基因测序或转送到参考实验室进行鉴定的菌株数量。随着细菌分离种类的增多，数据库的不断更新，未来MALDI-TOF MS技术对于少见菌的鉴定准确率将提高。

不同国家和地区诺卡菌菌种分布有所不同。美国和澳大利亚最常见分离菌种为新诺卡菌，法国和泰国为皮疽诺卡菌，我国的北京和河北地区报道以圣乔治教堂诺卡菌最常见[5]。本研究以皮疽诺卡菌(41.7%，5/12)最多，其次为圣乔治教堂诺卡菌(16.7%,2/12)，与HUANG等[10]报道结果基本一致。由于国内与国外文献关于诺卡菌报道的样本量偏少，菌种分布的差异可能还需进一步研究、证实。

不同诺卡菌的感染部位和感染途径有所差异，如脓肿诺卡菌、皮疽诺卡菌和盖尔森基兴诺卡菌主要造成肺部感染和播散性感染，巴西诺卡菌则常引起皮肤感染[2]。本研究1例腿部感染患者即由巴西诺卡菌引起。肺是诺卡菌最常侵犯的器官，可导致肺诺卡菌病[11]。本研究12株诺卡菌以呼吸道标本占比最高，为75%(9/12)。本研究1株天美诺卡菌分离自肺泡灌洗液，该菌是2007年在日本新发现的菌种，目前仅有4例报道[12-13]。

文献[14]报道，诺卡菌感染者中，免疫功能低下者较非免疫功能低下者病情更重，病死率更高，但二者临床表现无差异。本研究中64%(7/11)的患者有1种及以上基础疾病。2例放弃治疗者为典型的免疫功能低下人群，其中患者1患有肝炎、糖尿病和COPD，患者9患有支气管扩张症和肺癌，且二者年龄均超过70岁。2例无基础疾病者未使用抗菌药物，其中1例经鼻息肉摘除术后，通过盐水冲洗、雾化治疗后好转出院，随访治疗效果较好，考虑与局部病灶未扩散，手术治疗效果较好及患者无基础疾病有关。另1例仅针对呼吸道症状对症治疗后出院，不排除标本污染或者定植可能。

目前，治疗诺卡菌感染首选使用磺胺类药物，但本研究中诺卡菌对复方磺胺甲噁唑的耐药率为28.57%，高于黄磊等[15]的报道，不同于文献[16]报道的全部敏感，应引起重视。

综上所述，本院分离的诺卡菌以皮疽诺卡菌为主，肺部感染为主要感染方式，患者多患有1种及以上基础疾病，所以当临床使用常见抗菌药物效果不佳，患者伴有基础疾病或使用免疫抑制剂时应考虑诺卡菌感染的可能。MALDI-TOF MS技术可对临床少见的诺卡菌进行快速鉴定，实验室应逐步开展诺卡菌药敏试验，为临床合理用药提供可靠依据。

志谢：本研究16S rRNA基因测序及诺卡菌药敏试验均由上海市东方医院检验科郭建老师支持完成！