核酸负载纳米金的改良ELISA高灵敏检测平台的构建*

程 易，马粤婷，吴日红，徐 瑜，杨舒凌，王永霞

海南医学院教育部热带病重点实验室，海南海口 571109

酶联免疫吸附试验(ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种新型免疫检测技术，其测定原理是基于抗原与抗体的特异性结合反应及酶催化底物的高效放大作用，实现对目标分子的高灵敏检测[1-2]。由于操作简便、快速、特异性好、检测成本低且不需要复杂设备等，ELISA是目前临床和科研实验室应用最为广泛的免疫分析技术之一[3-4]。但传统ELISA由于酶标抗体上标记的酶分子数量有限导致检测灵敏度不高，传统ELISA只能检测水平大于10-12mol/L的目标物质，但在恶性肿瘤、感染、自身免疫疾病及超敏反应性疾病的早期阶段，大部分目标分子水平为10-16～<10-12mol/L，传统ELISA难以检测[5-7]。纳米金(AuNPs)因颗粒小、比表面积大、生物相容性好逐渐成为生物医学领域的研究热点[8-9]。本研究拟将AuNPs作为信号放大载体，通过金-硫键结合生物素化DNA(DNA-B)，构建纳米金生物素化DNA(AuNPs@DNA-B)信号探针，将该探针借助生物素-亲和素的高亲和力结合于检测抗体上，实现信号高效放大的目的，并选择血清含量极低、易引起过敏性疾病的抗体免疫球蛋白(Ig)E作为目标分子，验证该检测平台的信号放大效果。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 全功能微孔板检测酶标仪(BioTek Synergy H1)购于美国伯腾仪器有限公司；P9紫外-可见分光光度计购于上海美谱达仪器有限公司；高分辨率透射电镜(JEM 2100)购于日本电子株式会社；高速冷冻离心机(Microfuge®20R)购于贝克曼库尔特(美国)股份有限公司；电热恒温培养箱(BPX-162)购于上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；摇床(SLK-O3000-S)购于上海珂淮仪器有限公司。氯金酸(分子式：HAμCl4·4H2O；分析纯，批号：JG9031901)购于上海思域化工科技有限公司；二水合枸橼酸三钠(分子式：C6H5Na3O7·2H2O，分析纯)购于西陇科学股份有限公司；人IgE ELISA反应板及试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记亲和素(SA-HRP)和重组链霉亲和素(SA，分析纯)购于上海碧云天生物技术有限公司；DNA-B[5′-SH-(CH2)6-TTTTTTGTCAGCCAGTGTAC-biotin-3′]由上海生工生物工程有限公司合成。0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)购于赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1改良ELISA检测IgE的原理 首先制备13 nm AuNPs，设计合成一段含20个碱基的DNA-B序列，其5′端经巯基化修饰，3′端经生物素化修饰，将AuNPs与DNA-B通过金-硫键结合形成AuNPs@DNA-B作为本实验的信号探针。当IgE存在时，通过与微孔板上包被抗体的结合捕获IgE，再与Ab-B结合形成夹心“三明治”结构。信号探针AuNPs@DNA-B在链霉亲和素的辅助下与生物素化抗体结合而被固定在微孔板表面，洗涤后加入SA-HRP，以TMB和H2O2作为显色底物，待检物在一定水平范围内，其水平与显色深浅呈正相关。由于13 nm AuNPs比表面积大，DNA-B分子小、空间位阻小，每个AuNPs均可结合大量DNA-B分子，实现对检测信号的高效放大作用，且DNA-B中的DNA分子5′端经巯基化修饰后可与AuNPs通过金-硫键共价结合，DNA-B分子不易脱落，背景信号较低，信噪比较高，该方法与传统ELISA相比，可大大提高检测灵敏度。

1.2.2枸橼酸三钠还原氯金酸法[10]制备13 nm AuNPs 取100 mL 0.01%氯金酸溶液在控温搅拌器中加热至沸腾后，边搅拌边加入4.8 mL新鲜配制的1%枸橼酸三钠。溶液由淡黄色逐渐变为深紫红色，最后变为酒红色，搅拌至溶液颜色不再变化，撤去热源，继续搅拌10 min。待溶液冷却至室温后恢复至原体积，4 ℃保存。采用紫外-可见分光光度计和透射电镜对制备的AuNPs进行表征。

1.2.3制备AuNPs@DNA-B信号探针 室温下，将一定量的100 μmol/L DNA-B加入5 mL制备好的AuNPs溶液中，置于摇床缓慢摇动(200 r/min)。期间每隔4小时依次加入2 mmol/L NaCl溶液20、45、55、65、90 μL，12 000 r/min，6 ℃离心30 min。吸出上清液后加入0.01 mmol/L(pH 7.4)的PBS重悬沉淀，洗涤2次，最后1次离心后加入5 mL 15%牛血清清蛋白(BSA)，室温摇床摇动6 h后，12 000 r/min离心30 min，洗涤2次，沉淀储存于4 ℃备用。采用紫外-可见分光光度计和透射电镜对制备的探针进行表征。

1.2.4DNA-B结合AuNPs条件的优化 (1)DNA-B用量的优化。分别将2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4 μL 100 μmol/L DNA-B加入200 μL AuNPs溶液中。室温下置于摇床摇动24 h(200 r/min)，加入2 mmol/L NaCl溶液老化探针，离心取沉淀洗涤2次后测A260。实验重复3次。(2)DNA-B与AuNPs结合时间的优化。选择最佳结合量的AuNPs和DNA-B，200 r/min下分别结合12、16、20、24、28、32、36、40 h，加入2 mmol/L NaCl溶液使探针老化后离心，重悬后取沉淀测A260。实验重复3次。

1.2.5最佳反应条件的选择 选取强阳性(4 ng/mL)的IgE标准品作为优化反应条件的待测物，生物素化抗IgE抗体(Ab-B)用量由传统ELISA优化获得，采用棋盘滴定法对SA、AuNPs@DNA-B复合物用量进行优化。同时将SA-HRP从1∶1 000～1∶3 000做一系列稀释，在Ab-B、SA和AuNPs@DNA-B复合物最佳工作浓度下对SA-HRP的用量进行优化。实验重复3次。同时设置阴性对照和空白对照。

1.2.6标准曲线的绘制 将IgE标准品从0～30 ng/mL进行一系列稀释，分别取100 μL加入反应板中，37 ℃孵育90 min。洗涤后加入100 μL Ab-B，37 ℃孵育60 min，洗涤，加入100 μL 5 μg/mL的SA 37 ℃孵育30 min，洗涤，加入100 μL AuNPs@DNA-B孵育30 min，洗涤后加入1∶2 000 SA-HRP孵育30 min，洗涤后分别加入100 μL的四甲基联苯胺(TMB)和H2O2，37 ℃孵育15 min。加入终止液后测定各水平的吸光度变化值(A450-A630)，经直线回归分析，选择最佳线性范围作为IgE定量检测的反应曲线。

1.2.7方法实用性研究 将IgE标准品从0.1～2.0 ng/mL用标准血清进行一系列稀释，采用本实验建立的改良ELISA和传统ELISA分别检测IgE水平，计算回收率。比较两种方法检测IgE时回收率的差异。回收率(%)=检测值/实际值×100%。

2 结 果

2.1AuNPs 和AuNPs@DNA-B表征 采用紫外-可见分光光度计对制备的AuNPs、AuNPs@DNA-B进行扫描，在波长200～650 nm，扣除本底后得到如图1A所示的光谱图。由图1A可见AuNPs和AuNPs@DNA-B扫描曲线波峰宽度较小，波形平滑，初步证明制备的AuNPs颗粒大小一致，分布均匀。AuNPs在标记DNA-B前，紫外吸收光谱的最大吸收峰波长在519 nm处，但标记后其最大吸收峰波长变为522 nm，出现了轻微的红移，且在260 nm处出现了明显的吸收峰。透射电镜发现AuNPs的粒径为(13±2)nm，多为球形，大小基本一致，分散均匀(图1B)。

注：A为AuNPs及AuNPs@DNA-B紫外吸收光谱；B为AuNPs透射电镜结果。

2.2DNA-B结合AuNPs条件的优化

2.2.1DNA-B用量的优化 当AuNPs的用量一定时，扣除背景信号后，由图2可知，随着DNA-B用量的增加，A260逐渐增加，尤其DNA-B用量在2.4～2.8 μL时A260急剧增加，而用量在>2.8～3.4 μL时A260增速明显变缓，说明随着DNA-B用量的增加，其与AuNPs的结合量亦随之增加，直到达到其最大结合量。鉴于DNA-B在3.0～3.4 μL时A260接近最大值，且差别不大，因此本研究选用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 结合200 μL AuNPs作为二者后续实验的用量。

图2 结合AuNPs的DNA-B用量优化

2.2.2DNA-B与AuNPs结合时间的优化 在AuNPs和DNA-B最佳结合条件下，去除背景信号后，发现随着时间的延长，A260先迅速增加后增速变缓，说明DNA-B与AuNPs的结合达到一定时间后再增加结合时间并不能增加结合效率。由图3可知，32～40 h时A260增速缓慢，说明此时间段基本达到二者的最大结合量，因此选用36 h作为最佳结合时间。

图3 AuNPs与DNA-B结合时间优化

2.3改良ELISA最佳反应条件的选择

2.3.1SA和AuNPs@DNA-B用量优化 当IgE用量固定时，发现随着SA水平和AuNPs@DNA-B用量的增加，A450逐渐增加，但当SA水平为5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量为100 μL时，A450接近最大值，见图4。综合实验结果，SA选择5 μg/mL作为最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量选择100 μL。

图4 SA和AuNPs@DNA-B用量优化

2.3.2SA-HRP用量优化 在最优条件下，SA-HRP稀释度为1∶500～1∶3 000时A450下降缓慢，但超过1∶3 000则出现了明显下降，说明稀释度过高导致SA-HRP的用量不足，因此本研究选用1∶2 000作为SA-HRP的最终稀释度。

2.4精密度验证 取健康人血清及IgE阳性患者血清各10份在相同条件下重复检测10次，批间变异系数均<6.1%，取其中1份IgE阳性血清重复测定10次，批内变异系数<2.0%。

2.5标准曲线的绘制 将IgE标准品进行一系列稀释后，用改良ELISA检测各水平的A值，经直线回归分析(图5)，得回归方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，发现IgE水平在0～30 ng/mL内线性关系良好，其检测限为0.012 ng/mL。

图5 改良ELISA检测IgE标准曲线

2.6方法实用性研究 取IgE标准品用标准血清稀释后，采用改良ELISA和传统ELISA分别检测不同水平IgE标准品，计算回收率，发现改良ELISA回收率为(99.956±0.168)%～(104.733±3.376)%，传统ELISA为(99.100±0.529)～(100.044±0.276)%，略低于改良ELISA，但二者差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 改良和传统ELISA测定IgE的回收率

3 讨 论

随着纳米技术的发展，纳米材料在生物医学领域的应用备受关注[11]。纳米颗粒因具有较大的比表面积、量子尺寸效应以及与生物材料的高度相容性逐渐成为生物医学领域的研究热点[12-13]。AuNPs(1～100 nm)是微小的金颗粒，又称胶体金[14-15]。其具有高电子密度、介电特性和一定的催化作用，低毒且能与多种生物大分子结合，在医学治疗和检测领域应用广泛[16-17]。本研究将生物素化的DNA探针通过金-硫键结合于制备好的(13±2)nm的AuNPs上用于解决传统ELISA放大效果不佳的问题，构建了基于AuNPs的IgE检测改良ELISA。即在ELISA检测IgE的基础上将生物素化抗体与链霉亲和素结合，洗涤后链霉亲和素后再与AuNPs@DNA-B探针结合。由于每个AuNPs@DNA-B可与多个SA-HRP分子结合，加入TMB后使检测信号进一步放大。DNA探针长度的选择参考文献[18-19]，20 nm以下的AuNPs负载DNA探针的长度多在15～70 nt，由于本研究所用的AuNPs粒径较小，DNA探针的长度选择了20 nt(另含6个CH2基团)。

紫外-可见分光光度计对制备的AuNPs进行扫描，发现其最大吸收峰波长在519 nm处，峰宽度较小，波形平滑，说明制备的AuNPs大小一致，分散性好；透射电镜发现AuNPs粒径为(13±2)nm，呈球形。标记DNA-B后最大吸收峰波长出现了约3 nm的红移，且在260 nm处出现了吸收峰，说明DNA-B成功连接在了AuNPs上。未标记核酸的AuNPs与标记核酸的AuNPs光谱曲线形态基本一致，峰形变化不大，表明DNA-B标记后的AuNPs仍保持良好的稳定性。对DNA-B的用量及与AuNPs的结合时间优化发现：200 μL的AuNPs结合3.0～3.4 μL 100 μmol/L的 DNA-B时A260接近最大值，因此本研究选用3.0 μL 100 μmol/L DNA-B 作为200 μL AuNPs的最佳结合量；二者结合时间在32～40 h时A260接近峰值，本实验选择36 h作为二者的结合时间。通过对改良ELISA的最佳反应条件优化，发现当SA水平达5 μg/mL、AuNPs@DNA-B用量达100 μL以上时，A450接近最大值，因此选择5 μg/mL的SA作为最佳工作水平，AuNPs@DNA-B用量选择100 μL；同时在SA和AuNPs@DNA-B最佳用量条件下对SA-HRP用量进行了优化，发现SA-HRP稀释度超过1∶3 000时A450迅速下降，说明稀释度过高导致SA-HRP的结合容量不足，因此本研究选用1∶2 000作为SA-HRP的最终稀释度。将IgE标准品进行一系列稀释，用本实验构建的改良ELISA检测各水平的A450，发现IgE水平在0～30 ng/mL时，A450与IgE呈现良好的线性关系，回归方程：Y=0.139 84X+0.530 22，R2=0.983 32，其检测限为0.012 ng/mL，较传统ELISA的检测限(0.24 ng/mL)高约19倍。该平台检测的批内变异系数<2.0%，批间变异系数<6.1%，通过比较两种方法对不同水平IgE标准品的回收率，发现改良ELISA回收率稍高于传统ELISA，但二者差别不大。另外，本方法与其他常用方法相比，其灵敏度远高于传统的免疫印迹法，与化学发光法相近，但低于放射免疫法和荧光免疫法[20]。而放射免疫法除易造成放射性污染外，其与荧光免疫法均需要昂贵的仪器和试剂，难以在基层开展。

综上所述，笔者通过AuNPs@DNA-B探针借助生物素-亲和素间的高亲和作用，构建了改良的ELISA检测平台，大大提高了检测灵敏度，有较好的应用前景，为抗原/抗体的高灵敏检测提供了参考。