当归油对白及多糖微凝胶贴片中α-熊果苷体外透皮行为的影响*

赵 宁，付丽娜，李伟泽，王小宁，杨 霞

（西安医学院 药学院，陕西 西安 710021）

引 言

熊果苷是从多种不同植物中提取得到的天然活性物质，是葡萄糖基化的氢醌衍生物，广泛存在于动物、植物及微生物细胞中。由于熊果苷结构中的葡萄糖残基具有亲水性，酚羟基具有抑制黑色素合成酶的作用，故其常作为美白添加剂，用于化妆品行业，起保湿美白功效。目前常用的有两种类型：α-熊果苷和β-熊果苷。研究表明，α-熊果苷不仅在美白功效方面远远强于β-熊果苷，而且也更加安全[1]。因此随着研究的逐步深入，α-熊果苷作为美白剂的产品越来越多，在日化产业方面有着广阔的市场前景。

当归油是从伞形科植物当归（Angelica sinensis（Oliv.）Diels）的根中提取的一种具有特色香气的浅红棕色油状液体。其主要成分为藁本内酯，不仅能够抗炎、扩张毛细血管，增强血液循环，调节免疫功能，而且还有对皮肤滋养保护、促使干裂皮肤愈合的作用，因此作为添加剂广泛应用于护肤产品。同时，当归油也是一种良好的天然透皮吸收促进剂[2,3]，将其用于经皮制剂，可同时发挥治疗与促渗的协同作用。白及多糖（bletilla polysaccharide，BSP）是从兰科植物白及[Bletilla striata（Thund.）Reichb.f.]的干燥块茎中提出的一种水溶性高分子多糖，相对分子质量大，溶于水可形成生物黏附性良好的空间三维网状结构凝胶。BSP 具有良好的止血、抗炎、促进伤口及溃疡愈合、促进黏膜新生等多种药理作用，是一种性能优越的可生物降解的新型高分子材料[4]。因此本文以白及多糖为基质，以当归油为透皮吸收促进剂，制备白及多糖α-熊果苷微凝胶贴片，研究当归油对微凝胶贴片中α-熊果苷透皮吸收的促进作用及影响规律，为挥发油作为透皮吸收促进剂的进一步研究提供依据。

1 仪器与试药

电子天平（SE602F 奥豪斯仪器有限公司）；电子分析天平（QUINTIX224-ICN 赛多利斯科学仪器有限公司）；电热水浴箱（HH-S4 背景科伟永兴仪器有限公司）；鼓风干燥箱（DHG9140B 上海安亭科学仪器有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1260 美国安捷伦公司）；紫外可见分光光度计（UV-1780 岛津企业管理有限公司）；DSC 差式扫描量热仪（Stare 系统瑞士梅特勒-托利多公司）；磁力搅拌器（B11-1 上海司乐仪器有限公司）；扩散池（7mL，立式上海化科实验器材责任有限公司）。

白及药材（咸阳鸿玖药业有限公司）；α-熊果苷（含量99%，西安小草植物科技有限责任公司）；当归油（含量96%，吉安博锐香料油有限公司）；甘油（厦门星鲨制药有限公司）；甲醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

小鼠（雌性，22g，西安交通大学动物实验中心）。

2 方法与结果

2.1 白及多糖的提取工艺

称取白及药材20g，加入10 倍量水，浸泡90min后于恒温水浴中提取90min，设定提取温度90℃，提取2 次。合并提取液，于旋转蒸发仪中浓缩至浸膏状，使其含药量为每毫升1g，自然冷却后，用75%乙醇醇沉，静置过夜，在真空条件下抽滤，所得滤饼经干燥粉碎，即得。

2.2 白及多糖微凝胶贴片的制备

称取白及多糖4.0g，加入45mL 纯化水，于50℃水浴中搅拌溶解后，加入20g 甘油，搅拌均匀得白及多糖凝胶液；称取α-熊果苷1.0g，加入35mL 纯化水，于50℃水浴中搅拌溶解后，加入到白及多糖凝胶液中，沿同一方向搅拌均匀，分别称取20g 于5个烧杯中，依次加入当归油0，0.02，0.1，0.2，0.3mL。搅拌使当归油分散均匀，脱泡后，将上述混合溶液以匀浆法涂布于洁净玻璃板上制膜，氮气氛围40℃干燥，即得空白对照及含当归油浓度为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的α-熊果苷白及多糖微凝胶贴片，将其切割成1.5cm×1.5cm 大小若干块，密封保存，备用。

2.3 α-熊果苷含量测定方法的建立

色谱条件：色谱柱Zorbax Eclipse XDB-C18 柱（4.6mm×150mm，5.0μm），流动相：甲醇- 水（20∶80，V/V）；流速1.0mL/min，检测波长283nm，柱温为25℃，进样量20μL，如图3 所示，α-熊果苷的洗脱时间为2.77min 左右，峰形良好。

图1 白及多糖滤饼Fig. 1 The bletilla polysaccharide filter cake

图2 白及多糖凝胶液及微凝胶贴片Fig. 2 The bletilla polysaccharide gel and micro-gel patch

标准曲线的绘制：精密称取α-熊果苷对照品0.1g于100mL 容量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得1mg/mL 的对照品溶液。分别精密吸取α-熊果苷对照品溶液适量于25mL 容量瓶中，用纯化水定容配置成浓度为5、10、20、40、80、160μg/mL 的系列标准溶液。分别取20μL，经HPLC 检测，以α-熊果苷的峰面积为纵坐标（Y），以质量浓度（X）为横坐标进行线性回归（如图4 所示），得标准曲线方程Y=12.436X+12.612，R2=0.9997。结果表明，α-熊果苷在浓度范围5～160μg/mL 内具良好的线性关系。

精密度考察：精密吸取浓度为20μg/mL 的α-熊果苷标准溶液20μL，注入HPLC 中测定，重复进样5 次，根据峰面积计算精密度，结果RSD 为0.37%（n=5）。

稳定性考察：将配制好的20μg/mL 的α-熊果苷标准溶液在室温下放置，分别于0h、1h、3h、5h、7h、12h、24h 精密吸取20μL，注入HPLC 中测定，结果RSD 为0.24%（n=3），表明该样品稳定性良好。

回收率试验：取空白接收液1.0mL 分别加入高（80μg/mL）、中（40μg/mL）、低（20μg/mL）三个浓度梯度的α-熊果苷标准溶液，混合均匀后，精密吸取20μL 注入HPLC 测定，结果RSD 为0.91%，平均回收率103.81%（n=3）。

图4 线性关系图Fig. 4 The linearity

2.4 体外透皮试验

取小鼠脱颈处死，剥离腹部皮肤，剔除毛发并剥离皮下组织，用生理盐水冲洗干净，并切成3.0cm×3.0cm 大小，夹于立式扩散池中间，角质层面向供给池，真皮层面向接收池。将扩散池固定于恒温磁力搅拌器上，设定温度为32±0.5℃，搅拌速度100r/min。接收池中加入5mL 纯化水作为接收液，供给池中分别将含当归油0%、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的白及多糖微凝胶贴片小心黏附于小鼠皮肤角质层上，然后分别于0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5h 时取样0.2mL 并及时补液，样品经0.22μm 微孔滤膜过滤后，精密量取20μL 注入HPLC，按下式计算累积透过量。

式中ΔM 代表药物累积透过量；Ci 代表第i 次所取样品的浓度（μg/L）；V 代表释放介质体积（mL），A 为有效透过面积（cm2）。

图5 不同含量当归油微凝胶贴片中α-熊果苷累积释药图Fig. 5 The cumulative release of α-arbutin from micro-gel patch with different angelica oil contents

结果如图5 显示，含当归油的微凝胶贴片中α-熊果苷的累积透过量均高于空白对照组，表明当归油对白及多糖微凝胶贴片中的α-熊果苷的透皮吸收具有显著的促进作用。随着处方中当归油的浓度逐渐升高，α-熊果苷的累积透过量也随之增加，表明当归油对α-熊果苷的促渗作用具有一定的浓度依赖性，当归油浓度为1.0%时，α-熊果苷的累积透过量为最大，在4.5h 时1.0%当归油累积透过量分别是0.5%的1.14 倍、0.1%的1.56 倍、1.5%的1.42 倍、空白对照组的1.89 倍。当当归油的浓度升高至1.5%时，α-熊果苷的累积透过量反而有所下降，推测其原因可能与当归油对皮肤角质层类脂双分子层结构的影响有关。

2.5 差示扫描量热仪（DSC）分析

将2.4 项下各组试验后的皮肤置于生理盐水中冲洗，去除表面残留制剂，滤纸吸干水分，剪成约5mg 的小块，置于铝坩埚中密封，经差示扫描量热仪进行扫描分析，以未经作用的小鼠皮肤同法处理为空白对照，DSC 升温范围为-20～200℃，升温速率为20℃·min-1，测定气氛为高纯度N2。

图3 α-熊果苷HPLC 图Fig. 3 The HPLC of α-arbutin

结果如图6 所示：从对照组DSC 扫描图可看出，小鼠皮肤在140℃处有一明显的特征吸热峰，推测为皮肤角质层中蛋白质的变性峰，不含当归油的微凝胶贴片作用后的小鼠皮肤，其DSC 扫描图与对照组差别不大，而加了当归油的微贴片作用后的小鼠皮肤DSC 扫描图中角质层特征吸热峰随着当归油浓度的增加而明显减小，当当归油的浓度为1.0%时，特征吸热峰消失，推测原因可能是当归油改变了角质层细胞类脂质双分子层的空间结构，增加了双分子层流动性[5,6]，因此含当归油的凝胶贴剂作用后，小鼠皮肤在加热过程中的吸热导致相变所需的能量大大减少，导致角质层的特征吸热峰有所下降，当当归油的量达到1.0%时，类脂质双分子层细胞的有序排列被扰乱，转为无序，双分子层细胞接近流动的液晶态，因此特征吸热峰逐渐消失。

图6 小鼠皮肤用药前后DSC 分析图Fig. 6 The DSC analysis of mice’s skin before and after the administration of drug

3 讨 论

近年来，中药挥发油对药物经皮吸收的促进作用逐渐受到关注，如冰片、当归、薄荷、川芎、桉叶等[2]，其作用机制目前主要认为是挥发油作用于皮肤后可通过改变皮肤角质层细胞的有序排列、增强角质层水合作用以及拉动效应从而降低皮肤角质层的屏障作用，提高通透性。研究表明，一些挥发油的促渗效果显著优于月桂氮卓酮[7,8]。另外，挥发油来源于天然植物，本身也具有一定的药理活性，相比于化学促渗剂，其毒性小[9,10]。因此，以挥发油作为促渗剂，应用于制剂中，不仅能够增加制剂安全性，还可同时发挥促渗和治疗的双重作用。近年来从中药挥发油中寻找高效、安全的促渗剂已成为透皮给药领域的研究热点之一。