南海礁栖海藻共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41 403 次级代谢产物研究

叶禹秀, 罗小卫, 杨斌, 林秀萍, 刘永宏, 周雪峰

1. 广西中医药大学海洋药物研究院, 广西 南宁 530200;

2. 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 广东省海洋药物重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州510301;

3. 海南省热带海洋生物技术重点实验室, 三亚中科海洋研究院, 海南 三亚 572024

为适应复杂的海洋生态环境, 海藻共附生微生物可产生独特的次生代谢产物参与宿主的防御体系,帮助宿主抵抗外界致病菌和病毒的侵害, 以及其他海洋生物的攻击。这些独特的次生代谢产物往往骨架新颖、活性显著, 为新型海洋药物的研发提供宝贵资源(杨曦亮 等, 2020)。拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)作为一类分布较为广泛的内生真菌,其产生的次级代谢产物具有结构新颖性、生物活性丰富的特点, 很多具有较强的抗肿瘤、抗真菌、抗病毒活性(陈霈雯 等, 2019; 马丽丽 等, 2021)。对陆地植物和沿海红树植物共附生来源拟盘多毛孢属真菌的代谢产物研究相对较多, 如冼嘉韵 等(2017)从南海红树林植物桐花树来源的内生杂色拟盘多毛孢属真菌中分离得到具有良好抗肿瘤活性化合物pestalachlorides C 和抗炎活性的 pestalachlorides B。对海洋动植物来源的该属真菌代谢产物研究相对较少。本课题组前期从南海永兴岛海域采集的礁栖腔节藻属海藻(Coelarthrumsp.)中分离得到一株拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403,已经从中分离鉴定6 个具有较弱细胞毒性的天然产物, 2 个具有较明显的COX-2 抑制活性的二苯酮衍生物和1 个可作为肝脏X 受体α 调节剂的天然产物(Wang et al, 2020a, b; Liang et al, 2021)。然而, 该礁栖海藻共附生真菌代谢产物非常丰富, 仍有不少代谢产物尚未分离鉴定。因此, 本研究在HPLC 导向下对重新发酵的该菌株提取物进行化学成分研究,定向分离纯化该菌株中尚未鉴定的代谢产物, 以期发现更多结构新颖或活性显著的天然产物, 为海藻来源拟盘多毛孢属真菌的药用活性成分挖掘提供重要依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超导核磁共振仪(瑞士Bruker 公司AVANCE-500 MHz); 质谱仪(Waters 公司XEVO TQD); 高效液相色谱仪(日本岛津公司LC10AVP); 中压制备色谱(瑞士步琪 LC3000); 旋转蒸发仪(东京理化N-1100D-WD); 电子天平(德国塞多利斯股份公司BS110S); 数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限公司KQ-250DB); 三层多功能摇床(北京博宇宝威实验设备有限公司HYG-CXI 型); 自动蒸汽灭菌锅(合肥华泰医疗器械有限公司LX-B100L 型); 半制备色谱柱: YMC-Pack, ODS-A, 250×10mm,S-5μM ,12nm(YMC 公司); 薄层层析硅胶GF-254 和柱层析硅胶 200-300 目(烟台江友硅胶有限公司);HPLC 色谱纯试剂: 甲醇、乙腈(瑞典Oceanpark 公司); 实验分析纯试剂: 石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等(天津大茂化学试剂厂)。

1.2 菌种来源

菌株分离自采集于南海永兴岛附近海域珊瑚礁的腔节藻属海藻(Coelarthrumsp.), 鉴定为拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403(Wang et al, 2020a)。海藻和真菌菌株分别由中国科学院南海海洋研究所连喜平博士和林秀萍博士鉴定, 菌种样本保存在中国科学院南海海洋研究所海洋微生物研究中心(编号SCSIO41403)。

1.3 提取分离

菌株发酵过程见前期报道的方法(Wang et al,2020a)。获得的乙酸乙酯浸膏采用中压色谱柱进行分离, 用 100～200 目硅胶拌样, 经中压制备色谱分离(石油醚:CH2Cl2100:0～1:1)梯度洗脱后得到41 个馏分(Fr.1～Fr.41)。在高效液相分析导向下,定向分离之前尚未发现的代谢产物。Fr.4 经半制备高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分离纯化得到化合物 1(3.9mg), Fr.26 经半制备高效液相(CH3CN:H2O 34:66) 分离纯化得到化合物2(13.5mg)、化合物 5(5.9mg)和化合物 6(3.5mg);Fr.7 经半制备高效液相(CH3CN:H2O 90:10)分离纯化得到化合物 3(10.7mg); Fr.24 经半制备高效液相(CH3CN:H2O 70:30)纯化得到化合物4(9.1mg)。化合物1～6 结构如图1 所示。

1.4 抗菌活性实验

供抗菌活性筛选的菌株为白色念珠菌(Candida albicansATCC 10231)。采用K-B 法(Kirby-Bauer test)测定分离得到的6 个化合物对白色念珠菌的抑制活性(谭才邓 等, 2016)。

供试菌的准备: 将白色念珠菌菌种接种到LB琼脂培养基上活化24～48h, 然后接种于30mL LB 液体培养基中, 置于恒温震荡摇床中(28 ℃,180r·min-1), 培养24h。

试验平板的准备: 先往已冷却至 50℃左右的LB 半固体培养基中注入3mL 菌液, 混合均匀, 倾注平板约30mL, 静置待用。

抗菌活性测定: 将无菌干燥的空白滤纸片(直径 6mm)分别用移液枪滴加药物原液和对照溶液,每张滤纸片含待测待测化合物分别为5μg, 阴性对照为甲醇, 阳性对照为制霉菌素(nystatin)。将各含药纸片贴加于试验平板, 37℃恒温培养18～24h, 测定其纸片周围抑菌圈直径的大小。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物3: 白色粉末, 10.7mg, 分子式C11H12O4;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 5.20 (2H, s, H-2),3.76 (3H, s, 5-OMe), 2.19 (3H, s, 6-Me), 2.14 (3H, s,4-Me);13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 173.2 (C,C-1), 163.9 (C, C-5), 153.9 (C, C-7), 143.6 (C, C-3),118.6 (C, C-6), 116.7 (C, C-4), 106.2 (C, C-8), 70.2(CH2, C-2), 60.4 (O-CH3, 5-OMe), 11.5 (CH3, 4-Me),8.7 (CH3, 6-Me)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴 定 该 化 合 物 为 7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (Jia et al, 2015)。

化合物4: 白色粉末, 9.1mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 6.70 (1H, q,J=6.5 Hz, H-2’), 5.89 (1H, s, H-5), 5.44 (1H, s, H-3),3.80 (3H, s, 4-OMe), 1.82 (3H, d,J= 7.0 Hz, 2′-Me)1.80 (3H, s,1′-Me);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.6 (C, C-4), 164.5 (C, C-2), 161.4 (C, C-6),130.4 (CH, C-2′), 126.7 (C, C-1′), 97.3 (CH, C-5),88.1 (CH, C-3), 56.0 (CH3, 4-OMe), 14.4 (CH3,2′-Me), 12.2 (CH3, 1′-Me)。以上数据与文献报道基本一致, 故鉴定该化合物为pestalotiopyrones G (张宏岐 等, 2018)。

化合物5: 黄色粉末, 5.9mg, 分子式C7H6O2;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 9.88 (1H, s, H-7),7.82 (2H, dd,J= 8.1,1.0 Hz, H-2,6), 6.96 (2H, dd,J=8.1,1.0 Hz, H-3,5);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 191.1 (CH, C-7), 161.3 (C, C-4), 132.5 (CH,C-2), 132.5 (CH, C-6), 130.2 (C,C-1), 116.1 (CH, C-3),116.1 (CH, C-5)。以上数据与文献基本一致, 故鉴定该化合物为 4-hydroxybenzaldehyde (田倩倩 等,2010)。

化合物 6: 淡黄色粉末, 5.9 mg, 分子式C10H12O3;1H NMR (500 MHz, CDCl3)δHppm: 7.27(1H, s, 4-OH), 7.09 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-2,6),6.77 (2H, dd,J= 8.0,1.0 Hz, H-3,5), 4.24 (2H, t,J=6.8 Hz, H-8), 2.87 (2H, t,J= 6.8 Hz, H-7), 2.05 (3H, s,H-10);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δCppm: 171.3 (C,C-9), 154.3 (C, C-4), 130.1 (CH, C-2), 130.1 (CH,C-6), 120.5(C, C-1),115.4 (CH, C-3), 115.4 (CH, C-5),65.3 (CH2, C-8), 34.2 (CH2, C-7), 21.1 (CH3, C-10)。以上数据与文献基本一致, 故鉴定该化合物为4-羟基苯乙基乙酸酯 (韦玮 等, 2018)。

2.2 抗菌活性

通过观察试验平板发现化合物3(1mg·mL-1)对白色念珠菌有明显抑制活性, 其抑菌圈直径为25mm, 其他化合物无明显活性。阳性药 nystatin(25mg·mL-1)抑菌圈直径为30mm。

3 讨论

本文对腔节藻海藻来源拟盘多毛孢属真菌Pestalotiopsis neglectaSCSIO41403 的次级代谢产物进行了分离鉴定, 共分离出6 个单体化合物, 为首次从该菌株发现, 其中化合物1、2、5 和6 是首次从海洋动植物(不含红树植物)共附生微生物中发现。根据文献报道, 化合物6 对子宫颈癌细胞有显著抑制活性(关永强 等, 2014)。化合物3 对Cox-B3和RSV 有明显的抗病毒活性, 其IC50分别为39.0和78.0μmol·L-1(Jia et al, 2015)。本研究首次发现化合物3 对白色念珠菌有明显抑制活性。

根据文献报道, 海藻共附生真菌代谢产物的生物活性主要集中在抗菌和抗肿瘤领域, 其次为抗氧化、抗炎等其他活性。这些活性天然产物的产生与特殊的生存环境及宿主的生长调节、化学防御等生命活动密切相关(杨曦亮 等, 2020)。海藻共附生真菌活性次级代谢产物研究虽已取得一定进展, 但其具体的代谢意义和特殊性, 以及与藻类宿主的微妙关系仍有待深入探究。对于拟盘多毛孢属真菌, 文献中陆地植物和沿海红树植物来源的代谢产物研究相对较多, 而对海洋来源比如海藻共附生来源的, 其代谢产物和活性化合物研究相对较少。本研究为海藻共附生拟盘多毛孢属真菌的代谢产物研究及其药用活性挖掘提供了参考。