棉花抗枯萎病相关基因GhERF5-4D的克隆及功能分析

赵曾强 郭文婷 张析 李潇玲 张薇

（1.石河子大学农学院，石河子 832000；2.新疆农垦科学院生物技术研究所，石河子 832000）

棉花是纺织业主要原料，新疆作为我国主要棉花生产基地，2020年种植面积为250.19万hm2［1］，而枯萎病菌（Fusarium oxysporum）引起的棉花发病面积逐年加剧，培育抗病品种是防治棉花枯萎病最经济有效的措施，利用基因工程技术挖掘抗病基因，解析其调控机理，对培育抗病棉花品种具有重要意义［2-3］。

植物中第二大类转录因子AP2/ERF（ethylene response factor）能够影响植物多种品质特征［4-7］，该类家族基因含有典型的60-70个高度保守的氨基酸残基组成的AP2/ERF型DNA结合域［8］，根据保守域数量该类转录因子分为4个亚族AP2、ERF、RAV 和孤单亚族［4，9］，而 ERF 亚族只含有一个保守的AP2/ERF型DNA结合域，其C-端由18个氨基酸残基组成α-螺旋，与其他DNA元件或转录因子相互作用，N-端由3个反向平行的β-折叠构成的碱性亲水区域［10］。ERF转录因子是高等植物独有的一类转录因子，位于乙烯信号传导通路下游，参与一系列生物胁迫和非生物胁迫事件［4，11-12］。研究表明，拟南芥AtERF4过表达降低对枯萎病抗性，但该基因缺失后，其突变体提高对枯萎病抗性［13］，AtERF1［14］、AtORA59［15］过表达增强植株对灰霉病抗 性，AtERF1［14］、AtERF2［13］、AtERF14［16］过 表达增强植株对枯萎病抗性；烟草NtTsi1［17］、NtERF5［18］、NtOPBP1［19］过表达分别提高了烟草对细菌性斑点病、烟草花叶病毒病和烟草疫病抗性；番茄Pti4、Pti5、TSRF1过表达分别提高白粉病和细菌性斑点病、野火病和青枯病抗性［20］。总之，多数ERF转录因子过表达后能够提高植物抗病性，说明该类转录因子在转录调控中具有转录激活特性，在植物抗病性中起关键作用。

除拟南芥、烟草、番茄外，在小麦［21］、大麦［22］、大豆［23］、水稻［24］、苜蓿［25］中均发现该类转录因子能够参与植物对病原菌的胁迫响应；棉花GhERF4［26］、GhERF5［27］、GhERF2［28］、GhERF3［28］与 GhERF6［28］均可响应 ET、ABA、盐、冷及干旱诱导；GbERF1/2［29］在黄萎病菌侵染后其表达量明显升高，将其在烟草中过表达后，转基因烟草对一些真菌病害的抵抗能力提高，PR-1b、PR2a和PR4等病程相关蛋白基因的表达量均明显增加［10］。

虽然棉花中关于ERF转录因子研究较多，但主要以非生物胁迫为主，而关于棉花抗病相关转录因子基因报道不多，与抗枯萎病相关的转录因子基因的报道更是甚少。

本研究利用前期获得的枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据［30-31］，并从中筛选AP2/ERF家族表达差异基因为探针，结合棉花全基因组数据库选取与枯萎病响应相关AP2/ERF转录因子基因进行深入研究，丰富作物抗病基因资源，为农作物抗病性状的遗传改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

抗枯萎病陆地棉品种中棉所12、感枯萎病陆地棉品种新陆早7号、强致病力棉花枯萎病菌菌系F430、大肠杆菌感受态DH-5α由石河子大学棉花分子育种实验室提供，病毒诱导基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）载体由石河子大学农学院刘慧英老师惠赠。

1.2 方法

1.2.1 材料种植 选取饱满的种子播种于蛭石中，待棉苗长出第一片真叶后移至霍格兰培养液中，于26℃（光照16 h/黑暗8 h）培养，棉苗第一片真叶完全展平后用于后续试验。

1.2.2 枯萎病菌活化 将保存于-80℃的菌种在固体查式培养基划线26℃暗培养4-5 d后，将其放入液体查式培养基于26℃暗培养一周左右，调节孢子数至1×107个/mL备用。

1.2.3 材料处理 （1）枯萎病接菌处理：待棉苗第一片真叶完全展开，选取长势一致的幼苗伤根，棉苗浸泡于孢子浓度为1×107个/mL的枯萎病菌孢子悬浮液中40 min，而后转入霍格兰营养液。取未处理棉苗以及处理后1、3、6、12、24和48 h棉花根部组织，同时设置平行对照（mock），即相同生长环境下清水处理的棉花根部组织，取样时间一致。

（2）激素处理：待棉苗第一片真叶完全展开，选取长势一致的幼苗分别置于含有1 mmol/L ET、50 μmol/L SA、1 mmol/L JA溶液中浸泡40 min，然后，转移至新鲜霍格兰营养液中，取未处理棉苗以及处理后1、3、6、12、24和48 h棉花根部组织，同时设置平行对照（mock），即相同生长环境下清水处理的棉花根部组织，取样时间一致，样品经液氮冷激后-80℃保存备用。

1.2.4 棉花总RNA的提取及反转录 采用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，中国，目录号：RN38）提取棉花总RNA，使用TaKaRa公司cDNA第一链合成试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa中国），中国，目录号：6110A）进行cDNA合成，试验过程严格按照说明书操作。

1.2.5 GhERF5-4D的克隆及表达特征分析 以枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱中获得的差异表达基因为探针，结合棉花数据库，通过序列比对，从陆地棉中获得基因GhERF5-4D（GhERF5-4D原命名为GhERF1.1，Genbank：MF093148），依据ORF序列，利用Oligo7软件分别设计实时荧光定量（qPCR）引物和ORF全长引物（表1），利用RT-PCR技术扩增目的基因GhERF5-4D，扩增程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环 ；72℃10 min，通过系列试验验证后，将获得的阳性菌株送上海生工进行基因测序；利用qRT-PCR方法检测GhERF5-4D在不同胁迫处理下表达情况，以GhUBQ7（DQ116411）为内参基因，反应体系及程序参考全式金公司Trans start Tip Green qPCR Super Mix说明书，试验设3个重复，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.2.6 VIGS载体构建 根据GhERF5-4D非保守区设计沉默引物GhERF5-4D-CO，采用酶切连接方法进行VIGS载体构建，将构建好的pTRV2-GhERF5-4D-CO重组质粒通过电击法转入根癌农杆菌GV3101，菌液PCR筛选鉴定阳性菌株，引物见表1。

1.2.7 农杆菌介导的VIGS基因沉默 TRV为双粒RNA病毒，因此需要二元病毒载体共侵染棉花，分别将含pTRV2-GhCLA1和pTRV2-GhERF5-4D-CO重组质粒的农杆菌GV3101，挑取单克隆至10 mL LB（含25 mg/L庆大霉素和50 mg/L卡那霉素）液体培养基中，于28℃、180 r/min过夜培养后，将上述菌液按1∶50比例分别加至含终浓度为10 mmol/L的MES和20 μmol/L的乙酰丁香酮150 mL的LB（含25 mg/L庆大霉素和50 mg/L卡那霉素）培养基中，于28℃、180 r/min过夜培养；次日离心收集菌体沉淀（5 000 r/min，10 min），用重悬液（10 mmol/L的MES、200 μmol/L的乙酰丁香酮及10 mmol/L的MgCl2）重悬，室温放置3 h后，将含pTRV2载体、pTRV2-GhCLA1重组质粒、pTRV2-GhERF5-4D-CO重组质粒菌液分别与含pTRV1载体的菌液等体积混合，用注射器按压棉花叶子背面侵染，接种后将植株置于光照16 h 25℃/黑暗8 h 20℃培养，15 d后基因沉默植株再接种棉花枯萎病菌7号生理小种F430，检测沉默株系中抗病相关基因表达量情况，抗病相关基因引物详见表1，试验设计3个重复，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表1 引物列表Table 1 Table of primers

2 结果

2.1 GhERF5-4D的克隆及序列分析

以实验室前期获得的枯萎病菌诱导棉花根部基因表达谱数据为基础，从中筛选AP2/ERF（ethylene response factor）家族表达差异基因为探针，结合棉花数据库，通过序列比对从陆地棉D07染色体上获得一个ORF完整且无内含子基因GhERF5-4D，根据此序列设计该基因ORF全长引物，以棉花根部cDNA为模板进行RT-PCR扩增，获得ORF全长为663 bp，编码220个氨基酸（图1-A-C），利用SMART分析氨基酸编码区，结果（图1-D）显示，含有一个AP2结构域，属于ERF亚族，编码蛋白分子量24 910.25 Da，等电点9.30，利用PlantCARE对GhERF5-4D上游2 000 bp启动子序列分析发现，序列中除启动子核心元件和光响应元件外，还包括干旱响应元件、乙烯、脱落酸及茉莉酸响应元件、MYB结合位点及MYC识别位点（图1-E）。

图1 GhERF5-4D的PCR扩增及序列分析Fig.1 PCR amplification and sequence analysis of GhERF5-4 D gene

2.2 GhERF5-4D的表达分析

枯萎病菌侵染抗感病棉花品种后，运用qPCR方法分析GhERF5-4D的表达特征，抗病品种中，GhERF5-4D在各处理时间点表达量均高于mock，其表达趋势为先增加后降低，处理12 h时，其表达量是同时间点mock处理的2.4倍，为对照的8.4倍（图2-A）；感病品种中，枯萎病菌处理后，除12 h外，该基因在其它时间点的表达量均低于对照mock（图2-B），表达模式与抗病品种截然不同，推测该基因在棉花抗枯萎病中发挥着一定作用。

图2 棉花中枯萎病菌诱导下GhERF5-4D的表达模式Fig.2 Expression pattern of GhERF5-4 D gene after treat by Fusarium oxysporum in cotton

前期研究显示GhERF5-4D启动子区域含有激素响应顺式元件，通过研究3种激素处理抗病棉花品种并分析其表达特征，结果（图3）显示，乙烯（ethylene，ET）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）处理后，GhERF5-4D上调表达，且在ET处理3 h时达最大值，为同时期mock的4.2倍，而在MeJA处理6 h时，相对表达量达到峰值，为同时期mock的1.4倍；水杨酸处理后，各处理时间点的表达量均低于mock，为下调表达。

图3 不同激素处理下GhERF5-4D的表达模式Fig.3 Expression pattern of GhERF5-4 D gene after the treatment of different hormones

2.3 GhERF5-4D的VIGS载体构建

以棉花根部组织cDNA为模板进行PCR扩增，干扰片段约400 bp（图4-A），连接T载体进行双酶切验证（图4-B），将正确的重组质粒与VIGS载体pTRV2进行双酶切（Kpn I和Xba I双酶切），回收正确片段，利用酶切连接的方法构建pTRV2-GhERF5-4D-CO重组质粒，转化大肠杆菌，菌液PCR验证正确后提取质粒进行双酶切验证（图4-C），获得正确的重组pTRV2-GhERF5-4D-CO载体，采用电击法转入农杆菌GV3101，菌液PCR验证正确后-80℃保存备用（图4-D）。

图4 pTRV2-GhERF5-4D-CO载体的构建Fig.4 Vector construction of pTRV2-GhERF5-4D-CO

2.4 GhERF5-4D的沉默效率检测

以GhCLA1为报告基因，注射15 d后，棉苗真叶完全白化（图5-A），表明报告基因GhERF5-4D已被沉默，该载体可用于棉花中基因功能研究，进一步检测GhERF5-4D的沉默效率，分别提取注射空载与pTRV2-GhERF5-4D-CO棉苗根部组织总RNA，利用qRT-PCR分析该基因的相对表达量，结果（图5-B）表明，其相对表达量均明显低于对照，为对照表达量的20%。

图5 GhERF5-4D沉默效率与叶片漂白情况Fig.5 GhERF5-4D gene silencing efficiency and leaf bleaching

2.5 沉默株系接菌试验及病原菌恢复培养

以注射空载植株为对照，对沉默目的基因的植株进行枯萎病菌接菌处理并观察发病情况，接菌12 d时，注射空载的棉苗和沉默目的基因的棉苗均出现发病迹象，但注射空载棉苗下部少量叶片变黄，出现萎蔫现象，而沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗叶片黄化数目明显多于注射空载菌液的棉苗，且上部叶片也出现黄化症状（图6-A）；接菌20 d时，棉苗叶片开始失绿发黄，逐渐变软，最后呈干枯状态，而沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗叶片黄化、干枯以及脱落的数量明显高于注射空载菌液的棉苗；分别取子叶节上端同一部位茎段进行病原菌恢复培养，培养20 d时注射空载棉苗和沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗均能分离出枯萎病菌，但沉默目的基因（pTRV1∶pTRV2-GhERF5-4D-CO）棉苗分离出的枯萎病菌生长更快，以上结果说明沉默目的基因的植株与对照相比对枯萎病菌耐受性更弱，更易被枯萎病菌侵染，表明GhERF5-4D参与了棉花对枯萎病菌的抗性响应。

图6 GhERF5-4D沉默后接菌处理Fig.6 GhERF5-4 D gene silencing followed by bacterial treatment

2.6 沉默株系中防卫基因的表达特征分析

以GhCLA1为报告基因，待棉苗真叶完全白化时，对沉默目的基因的棉苗进行枯萎病菌接菌处理，取注射空载及沉默目的基因植株接菌6 h根部组织提取总RNA，利用qRT-PCR分析与抗病相关防卫基因的表达特征，与对照相比，PR1相对表达量变化不明显，而PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1相对表达量均不同程度低于对照，分别为对照表达量的64%、20%、69%、77%和72%，而WRKY70相对表达量高于对照，为对照的1.38倍（图7）。

图7 与抗病相关防卫基因表达特征分析Fig.7 Expression characteristics of defense genes related to disease resistance

3 讨论

植物在其生长周期内，无时无刻遭受生物胁迫和非生物胁迫危害，众多研究表明转录因子家族通过调控乙烯、茉莉酸和水杨酸等次级信号转导途径在抗病过程中扮演重要的角色［32-33］。ERF转录因子家族是高等植物独有的一类转录因子，位于乙烯和茉莉酸信号转导途径的关键节点，能够调控下游抗病相关防卫基因（如PR基因）表达，增强植物对病原菌的抵抗能力［34-35］。

本研究以枯萎病菌诱导棉花基因表达谱数据为依据并结合棉花全基因组数据库，从陆地棉D07染色体上获得1个ORF完整、含1个AP2结构域且无内含子的ERF亚族基因GhERF5-4D，qRT-PCR技术分析该基因在抗感病品种中接种枯萎病菌后表达特征，结果显示，GhERF5-4D在抗感病棉花品种中表达特征存在明显差异，抗病品种中该基因上调表达，感病品种中该基因下调表达，此结果与Guo等［36］研究结果相似，即海岛棉中获得的ERF类转录因子基因GbERF1-like在抗病感病品种间受黄萎病菌诱导后表达模式存在差异，表明GhERF5-4D能够响应枯萎病菌侵染，且该基因在棉花抗枯萎病中发挥着一定作用。

在此结果基础上，通过3种激素处理抗病棉花品种并分析GhERF5-4D表达特征，结果显示，乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）处理后，该基因为上调表达，而水杨酸处理后，该基因为下调表达，表明该基因参与ET、JA和SA三条信号路径，且ET、MeJA正调控GhERF5-4D表达，而SA负调控GhERF5-4D表达；研究显示，多数与抗病相关的ERF转录因子基因的表达都受到病原菌以及不同激素诱导［37-38］，表明ERF家族基因大多数受ET、SA和JA等抗病信号分子所诱导，且在作物抗病反应中起重要作用［39-41］；金莉［42］研究表明GbERF1在拟南芥中响应ET和SA信号通路，ET-SA起协同作用诱导GbERF1的表达，增加了对黄萎病的抗性，因此，推测GhERF5-4D能被ET/MeJA协同诱导GhERF5-4D的表达，增加棉花对枯萎病抗性。

本研究利用VIGS技术沉默GhERF5-4D后并进行接菌试验，结果表明，与对照相比，沉默株系更感病，选取接种6 h的根部组织进行下游抗病相关防卫基因表达特征分析，结果显示，与对照相比，PR1的表达量变化不明显，但PR2、PR4、PR5、NPR1、ERF1表达量均在不同程度低于对照，WRKY70相对表达量高于对照，由此推测GhERF5-4D通过调控下游 PR2、PR4、PR5、NPR1、WRKY70、ERF1表 达调节棉花对枯萎病的抗性。前人研究发现，ERF转录因子基因在植物抗病过程中是通过多数基因相互协同，如Moffat等［43］对拟南芥灰霉菌感病性研究发现，拟南芥ERF5与ERF6的过表达株系抗病性明显得到增强。Oñate-Sánche等［16］研究发现，许多转录因子具有相似的结合和调控效力，这导致大量的转录因子之间存在功能冗余现象。李文正等［44］研究发现，多数ERF转录因子基因受到ET、茉莉酸、水杨酸、脱落酸等次级信号分子的诱导，并且在植物的应激反应中起着极其重要的作用。

4 结论

从陆地棉获得一个ERF亚族基因GhERF5-4D，ORF为663 bp，编码220个氨基酸，启动子序列中包括多个激素和胁迫响应元件，能够响应枯萎病菌与ET、MeJA、SA胁迫，基因沉默后，沉默植株更感病，推测GhERF5-4D可能通过参与乙烯、茉莉酸途径调控下游抗病相关防卫基因调节棉花对枯萎病的抗性。