Burkholderia sp.GD17对水稻幼苗镉耐受的调节

祖国蔷 胡哲 王琪 李光哲 郝林

（沈阳师范大学生命科学学院，沈阳 110034）

镉（Cd）是农田土壤和地下水主要重金属污染物之一，其主要污染源是人们的日常生产过程和生活活动，如采矿、电镀、冶金、废弃物燃烧、含Cd农药和化肥的大量使用等［1］。由于Cd在土壤中的稳定性和分布的广泛性，使其污染治理变得十分困难。通过土壤-植物循环，Cd可进入植物体并高度积累。目前，相关研究主要聚焦于两个方面：一是利用高积累植物对Cd污染土壤进行植物修复［2］，二是减少Cd在作物中的积累，从而降低其通过食物链对人类健康的危害［3］。

Cd主要通过根系进入植物体内，在较低浓度下即可抑制植物生长、降低产量。Cd对植物伤害的机理是多方面的，如与结构蛋白和功能蛋白（尤其是酶）的基团（如巯基、组氨酰基、羧基）结合，或取代酶活性中心的金属辅基，干扰其生物学功能；引发活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生，从而造成次级伤害，如破坏生物大分子（蛋白质、核酸）的结构与功能、破坏生物膜的稳定性等。此外，细胞内的Cd严重干扰或抑制植物的基础代谢过程，如细胞分裂、光合作用、激素合成、营养元素的吸收等［4-5］。与其他主要作物相比，水稻对Cd的吸收速率更高。在水培条件下，水稻对Cd的最大吸收速率分别是小麦和玉米的6.5和2.2倍［6］。因此，水稻是Cd通过食物链进入人体的主要作物［7］。例如，我国居民通过日常食物吸收Cd的总量约55.8%是由食用稻米“贡献”的［8］。因此，调节水稻植株对Cd的吸收、根-茎转移等，既可提高植株对Cd的耐受性，又可减少Cd在光合组织中积累并向籽粒转移，对农业绿色生产具有重要意义。

为了降低Cd在籽粒中的积累，在水稻农业生产实践中运用了许多行之有效的管理措施。如给植物或根际土壤施喂（加）生长调节剂、矿物营养元素、石灰岩或粉煤灰、有机添加剂等［9］。此外，越来越多研究表明，施加植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）可有效降低水稻对Cd的吸收、调节Cd在体内的化学状态和亚细胞间的分布，从而降低其植物毒性以及向籽粒的转移等［3，10］。

前期的研究中，沈阳师范大学微生物实验室从野生大豆根中分离出一株PGPR，它具有固氮、解磷、合成吲哚乙酸、产生ACC脱氨酶活性等能力。根据16S rDNA序列同源性比对，该菌株与Burkholderia sp.KY357336.1具有100%的同源性，因此，将其命名为Burkholderia sp.GD17［11］。本研究以接种GD17和未接菌的幼苗为材料，分析施加GD17菌株对水稻幼苗Cd的吸收以及后续应答过程中的调节作用。重点针对Cd的根-茎运输、氧化伤害和抗氧化防卫应答、光合作用损伤及修复、Cd耐受相关基因的表达等，为减少Cd的积累、提高植株的Cd耐受性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

粳稻（Oryza sativa L.cv.元发9号）种子购自于辽宁东亚种业有限公司。将健康饱满的种子于5%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗5次，将种子平铺于湿润的滤纸上（直径9 cm培养皿平铺2层Whatman No.1滤纸，加入10 mL无菌水），于28℃黑暗催芽48 h。选取发芽一致的种子播种于塑料盆中（上口径12 cm、下口径8 cm、高12 cm；培养基质为高压灭菌的市售草炭土∶蛭石3∶1，V∶V），每盆15粒。培养条件为光照14 h（200 μmol/（m2·s））、黑暗10 h，温度为28℃/22℃（光/暗），相对湿度为70%。细菌接种：在种子催芽期间，以10 mL处于对数期的GD17发酵液（108个细菌/mL）代替无菌水。Cd胁迫处理：将固体CdCl2与培养基质均匀混合，Cd的终浓度为20和40 mg/kg。试验设对照组（不加菌和Cd）、加菌组（+GD17）、加Cd组（+Cd）和加菌加Cd组（GD17+Cd）。植株生长20 d后用于生理生化和基因表达分析。

1.2 方法

1.2.1 GD17在根中的定殖、植株生长与Cd含量测定 参照Yang等［12］方法，采用菌落形成单位（colony forming units，CFU）评估GD17在根中的定殖效率。随机从对照组和20 mg/kg Cd处理组的各5株植株收集根样品，于3%次氯酸钠溶液中振荡5 min，无菌水冲洗3次。将最后一次的冲洗液涂平板未检出任何菌。将表面杀菌的样品于研钵中充分研磨，收集样品于50 mL的具盖烧瓶中，加入15 mL无菌水，于旋转摇床（150 r/min）上匀浆30 min。静置至组织碎片沉降，吸取上清，并制成10倍的系列稀释液。涂布接种于LB平板上，于28℃培养2 d，计数CFU。在试验条件下，只检出一种菌落，且符合GD17菌落特征。植株的生长分别以地上部分和根的鲜重与干重表示。从每一组随机选取20棵植株，去离子水冲洗3次后用滤纸吸干表面水分，于根茎处分离，分别称鲜重。将各样品置于80℃烘箱中烘干48 h，称干重。样品中Cd含量测定：将上述烘干的对照组和20 mg/kg Cd处理组的地上部分和根样品（每份0.15-0.2 g）分别于研钵中研磨成粉末，于5 mL浓硝酸中消化。根据仪器说明书，采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪（iCAP 6000，美国热电公司）对Cd含量进行分析。用CdCl2溶液制作标准曲线。

1.2.2 丙二醛含量和抗氧化酶活性测定 采用硫代巴比妥酸法［13］测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。采用氮蓝四唑还原法［14］测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（catalase，CAT）活性；依据Hemeda等［15］方法测定过氧化物酶（peroxidase，PRX）活性。参照李合生等［13］方法测定酶提取液中总蛋白质含量。

1.2.3 光合作用相关参数的测定 参照王学奎等［14］方法进行总叶绿素提取与含量分析。使用便携式光合测定系统（LI-6400XT，美国LI-COR）测定叶片净光合速率（photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（stomatal conductance，Gs）和胞间 CO2浓度（intercellular CO2concentration，Ci）。参照仪器说明书，使用动力学荧光成像系统（FluorCam，捷克Photon Systems Instruments Ltd.）对叶绿素荧光参数进行成像分析，系统自带软件FluorCam 7.0自动求得PSⅡ最大光化学效率（maximal photochemical efficiency of PSII，Fv/Fm）、实际光化学效率（actual photochemical efficiency of PSII，ФPSII）、电子传递效率（electron transport rate，ETR）和非光化学荧光猝灭系数（non-photochemical quenching of fluorescence，NPQ）的平均值。

1.2.4 基因表达分析 随机从4组供试植株中分别选取10株植株，收集根并置入液氮中，用研钵研磨成粉末。采用SV Total RNA Isolation System（Promega）提取总RNA，采用PrimeScript RT Reagen Kit（TaKaRa）试剂盒合成cDNA第一条链。参照文献［16-17］，利用实时荧光定量PCR仪（Lightcycler 96，瑞士Roche）分析基因表达水平，以PK（Os06g0702800）、NABP（Os06g0215200） 和 TCTP（Os11g0660500）为内参，利用比较2-ΔΔCT法计算各个基因的相对表达水平。基因特异性引物序列见表1。

表1 基因表达分析特异性引物Table 1 Primer sequences used for the analysis of gene expression

1.2.5 数据处理与分析 文中数据均为3次独立生物学试验的平均值±标准差（n=3）。采用SAS软件进行ANOVA分析，经Duncan法进行多重比较，P＜0.05为显著性差异，图中以不同小写字母区分。

2 结果

2.1 GD17在根中的定殖、植物生长和Cd含量

为了检测GD17菌株在根中的定殖效率，分别在植株生长5、10和20 d时收集根样品。结果（图1）显示，在加20 mg/kg Cd的基质中生长5 d的植株根中GD17菌的数量达到3.6×106CFU/g根鲜重，10和20 d龄植株中内生菌数量维持在这一级别。同时也检测了在不加Cd或加40 mg/kg Cd的基质中生长20 d后植株根内生菌数量，结果与上述数值一致（图1）。未接种GD17的对照植株根中未检出GD17菌。接种GD17对正常条件下（不加Cd）生长20 d的植株干鲜重没有明显影响，但显著减缓Cd胁迫（20或40 mg/kg）对植株生长的抑制，具体表现在地上部和根的鲜重与干重（图2-A-D）以及植株的形态表型（图2-E）。基于Cd胁迫引发的植株可见伤害程度，接种GD17对植株根中的Cd积累没有明显影响（图2-F），但显著抑制Cd向地上部的转移，如加GD17植株地上部的Cd含量是未接菌植株的43%（图2-G）。

图1 GD17菌在根中的定殖效率（以菌落形成单位表示）Fig.1 Colonization efficiency of GD17 inside roots as indicated by colony-forming units（CFU）

图2 GD17和（或）Cd胁迫对植株生长和Cd含量的影响Fig.2 Effects of GD17 and（or）Cd stress on plant growth and Cd contents

2.2 氧化胁迫和抗氧化防卫

暴露于20 mg/kg Cd造成植株根和叶片氧化伤害，如MDA含量显著升高，接种GD17有效减缓Cd引发的氧化伤害程度，如根和地上部MDA分别是未接菌的78%和64%（图3-A、B）。无论是在对照（不加Cd）或Cd胁迫下，接种GD17植株根和叶片的SOD活性均低于未接菌的水平（图3-C、D），但PRX和CAT活性均高于未接菌的水平（图3-E-H）。

图3 GD17和（或）Cd胁迫对植株丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响Fig.3 Effects of GD17 and（or）Cd stress on malondialdehyde（MDA）content of plants，and activities of antioxidation enzymes

2.3 光合作用相关参数

与对照相比，暴露于Cd显著降低了植株的总叶绿素含量、净光合速率和气孔导度，接种GD17减缓了Cd的抑制作用（图4-A-C）。在Cd胁迫下，未接菌植株的胞间CO2浓度升高，但接种GD17植株不受影响（图4-D）。相似地，叶绿素荧光参数中的最大光化学效率（Fv/Fm）、实际光化学效率（ФPSII）和电子传递效率（ETR）在加Cd的未接菌植株中显著降低，而在接种GD17植株中保持不变或降低程度减轻（图5）。Cd胁迫下，非光化学荧光猝灭系数（NPQ）显著升高，尤其是接种GD17植株（图5）。荧光成像图也准确地反映了Cd胁迫引发的上述荧光参数变化趋势（图5）。

图4 GD17和（或）Cd胁迫对光合作用相关参数的影响Fig.4 Effects of GD17 and（or）Cd stress on photosynthesis-related parameters

图5 GD17和（或）Cd胁迫对叶绿素荧光参数的影响Fig.5 Effects of GD17 and（or）Cd stress on chlorophyll fluorescence parameters

2.4 Cd耐受相关基因表达

HMA（heavy metal-transporting P-type ATPases）编码的ATP酶参与Cd及其他金属离子的吸收和转运。HMA1和HMA3的表达受Cd暴露上调，尤其是在接种GD17植株（图6-A、B）。NRAMP5（natural resistance-associated macrophage protein 5）编码一种Cd转运体，参与植物对Cd的吸收和转运。该基因表达受Cd胁迫诱导，其中在接种GD17植株中尤为明显（图6-C）。MT（metallothionein-like protein）编码类金属硫蛋白，参与植物对Cd胁迫引发的活性氧清除。Cd暴露上调了MT1a的表达，尤其是在接种GD17植株（图6-D）；MT1c的表达在未接菌植株中受Cd胁迫轻微抑制，但在接种GD17植株中被显著诱导（图6-E）。PCS（phytochelatin synthase）编码植物络合素合成酶，参与植物体内络合素-Cd复合体（PC-Cd）的形成。PCS1和PCS2在Cd胁迫的接种GD17植株中呈现出显著的高表达（图6-F、G）。ABC（ATP-binding cassette protein）编码ABC转运体，参与PC-Cd复合体由细胞质转运至液泡。ABCG5的表达受Cd胁迫诱导，尤其是在接种GD17植株（图6-H）。

图6 GD17和（或）Cd胁迫对Cd耐受相关基因根中表达的影响Fig.6 Effects of GD17 and（or）Cd stress on the expression of Cd tolerance-related genes in roots

3 讨论

减少Cd在水稻中的积累对降低人类通过食物链吸入过量Cd具有十分重要的意义。本研究在种子萌发（催芽）期间，外加Burkholderia sp.GD17菌有效提高了水稻幼苗对Cd胁迫的耐受性，其可能的机理与Cd的根-茎运输、植物的抗氧化防卫反应、光合作用相关过程以及Cd耐受相关基因的表达调节有关。已有研究表明，Burkholderia属某些菌株具有Cd高积累特性，例如B.cepacia GYP1积累的 Cd 达到每克干重 116 mg［18］。Burkholderia sp.Z-90可从污染土壤中去除Cd的效率达到37.7%［19］；B.cenocepacia YG-3可去除500 mg/L Cd溶液中接近60%的Cd［20］。水稻根接种Burkholderia sp.Y4不仅减少Cd的吸收，也显著降低其向地上部以及籽粒的运输［21］。在本研究中，接种B.sp.GD17对根中的Cd积累没有明显影响，但显著降低其在地上部的积累。这表明接种GD17不仅限制了Cd的根-茎转运，同时也减少了植株根对Cd的吸收。关于前者的可能机理，本文在Cd耐受相关基因表达部分加以讨论，然而，对于后者仍需进一步的研究加以阐明。

作为非氧化还原金属离子，Cd不直接引发植物产生活性氧（ROS），但其可以通过干扰植物正常代谢（如光合作用）间接造成植物氧化伤害［22］。在本研究中，暴露于Cd导致根和叶片MDA显著积累，表明植物受到氧化伤害。接种GD17有效降低了MDA的积累，表明接种GD17植株对Cd的耐受性与降低的氧化伤害相关。此外，在Cd胁迫下，相比于未接菌植株，接种GD17植株的抗氧化酶PRX和CAT活性在一定程度上调了，这两种酶主要参与H2O2的清除。接种GD17显著降低了根和地上部SOD活性。基于SOD的诱导酶特性，这进一步反映了接种GD17抑制了ROS（尤其是O2-·）的产生。以前的研究也表明，Burkholderia sp.介导的水稻对盐胁迫耐受性伴随着SOD活性的降低［23］。根际促生菌Enterobacter sp.提高水稻幼苗对Cd的耐受性与降低的氧化伤害和提高的抗氧化能力相关［24］。

Cd暴露全面抑制水稻的光合作用，包括破坏叶绿体结构、降低气孔导度、抑制光能吸收和光化学转化等，从而降低净光合速率［25］。不断增加的证据显示，根际促生菌提高植物对Cd的耐受性与光合作用相关过程的保护有关。例如，Burkholderia gladioli显著减轻Cd对番茄植株生长的抑制与提高的光合作用能力（如色素含量、净光合速率、气孔导度等）相关［26］。在本研究中，Cd胁迫降低了未接菌植株的总叶绿素含量、净光合速率和气孔导度，提高了胞间CO2浓度，但在接种GD17植株中，这些参数在一定程度上得以修正。叶绿素荧光成像也揭示了GD17对Cd引发的光合作用损伤的修复。Fv/Fm比值反映了PSII捕光天线色素吸收的光能转化为化学能的潜在最大效率。在正常环境条件下生长的植物Fv/Fm为0.8左右，在胁迫条件下，其下降程度反映了PSII受光抑制的程度［27］。本研究中，在Cd胁迫下，虽然未接菌植株的Fv/Fm只是适度降低，但与对照相比达到了显著性差异，而接种GD17植株与对照水平接近，表明GD17阻止了Cd引发的PSII光抑制。这可能与接种GD17植株将更多的吸收光能转化为化学能有关。ФPSII反映植物吸收的光能转化为化学能的实际比例，广泛用于揭示胁迫条件引发的光合作用受限程度。本研究ФPSII的差异变化表明GD17菌可有效减缓Cd对光化学反应的抑制，这与净光合速率变化趋势一致。PSII的光抑制显著影响光合电子传递速率［28］。本研究中的ETR变化趋势反映了这一点。在胁迫条件下，植物吸收的过量光能（即超过其光化学反应的用量）以热的形式释放对减轻光系统的光损伤起重要作用。本研究中NPQ变化趋势表明过量吸收光能的热失散是接种GD17植株对Cd耐受的机理之一。以前的研究显示，根际促生菌Pseudomonas fluorescens促进高积累植物Sedum alfredii对Cd的耐受性伴随着提高的光合作用效率和叶绿素荧光参数［29］。

植物对Cd的吸收以及Cd在体内的转运、分布、区划等受多方面因素的调节，其中某些特异的金属转运体起重要作用。水稻基因组中已识别出9个HMA，其中，OsHMA1-OsHMA3属于Zn/Co/Cd/Pb亚组［30］。OsHMA1在水稻根及地上部（包括花器官或组织）均可表达。虽然OsHMA1被认为只参与Zn的转运，但其表达也受Cd的诱导［31］。本研究结果与之一致。OsHMA3主要在水稻根中表达，且在根的不同部位表达水平无显著差异，OsHMA3定位于液泡膜上［32］。OsHMA3只负责Cd的转运，将其转入根部液泡，进而限制其根-茎转移［30，32］。例如，OsHMA3过表达的转基因水稻（Nipponbare）Cd含量显著低于对照，且OsHMA3在Cd高积累的水稻品种（Anjana Dhan）中异源表达可显著降低Cd在地上部的积累［32］。基于此，本研究结果表明，接种GD17植株地上部显著降低的Cd积累可能与HMA介导的根部Cd液泡区划相关。

在水稻基因组中已识别出7个NRAMP基因（OsNRAMP1-OsNRAMP7），其中，OsNRAMP5位于根的质膜中，是水稻吸收Cd/Mn的主要转运体，也参与Cd根-茎运输的调节［33-34］。例如，利用RNAi抑制OsNRAMP5的表达提高了Cd在水稻地上部的积累，反之，OsNRAMP5过表达显著减少Cd在地上部的积累［34］。OsNRAMP5过表达的转基因水稻根对Cd的吸收增加了，但其地上部以及籽粒中的Cd含量较对照显著降低，这可能与OsNRAMP5干扰Cd的木质部加载，进而影响其根-茎运输有关［35］。基于此，本研究中接种GD17显著降低地上部的Cd积累可能与提高的OsNRAMP5表达水平相关。不过在不同水稻品种中对OsNRAMP5的遗传操作也得到了相反的结果。如利用离子束辐射或CRISPR/Cas9系统对OsNRAMP5敲除的水稻突变体根、地上部以及籽粒中的Cd含量显著低于野生型水平［33，36］。

水稻基因组中已识别出15个MT基因，它们主要参与植物对金属的络合以及ROS清除［37］。由于已发表的相关论文中对水稻MT基因符号的使用很不一致，因此建议以水稻RAP基因识别号为准（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）进行比较。在本研究中，MT1a（OS11g0704500） 和 MT1c（Os12g0571100）的表达模式表明，接种GD17植株对Cd的耐受性可能与MT的生物学作用相关。已有证据表明这2个基因的表达受Cd胁迫诱导［38］。

植物络合素（phytochelatins，PCs）是植物体内另一类金属络合配体。与上述MT不同，PCs主要与非必需毒性重金属或金属类似物结合，如与Cd络合形成PC-Cd复合体。在细胞内，PCs以谷胱甘肽为前体，由络合素合成酶（phytochelatin synthases，PCSs）催化合成。与其他高等植物一样，水稻基因组中有2个PCS编码基因，OsPCS1（Os05g0415200）和 OsPCS2（Os06g0102300），其中 OsPCS2是催化PC合成的主要同工酶［39］。在Cd胁迫下，这2个基因在水稻根中表达水平与不加Cd的对照水平接近［40］。拟南芥AtPCS1功能缺失突变体cad1-3植株在3 μmol/L的Cd胁迫下，根的生长几乎被抑制，但在功能互补试验中，OsPCS2转基因植株（cad1-3/OsPCS2）根的生长完全恢复至野生型水平，而cad1-3/OsPCS1植株也有明显的恢复［40］。在水稻中，OSPCS2的T-DNA插入突变体幼苗生长受Cd胁迫（1 μmol/L）的显著抑制［40］。在本研究中，2个PCS基因的表达模式表明接种GD17植株对Cd的耐受性可能与PCS合成的转录调节有关。

在植物体内，PC-Cd复合体由细胞质转运至液泡中隔离，从而减轻Cd对植物的伤害，是植物对Cd耐受的重要机理之一。其中，部分ABC转运体参与这一过程［41］。水稻基因组中至少有120个ABC转运体编码基因［42］，不过只有较少的几个成员在植物对Cd耐受机理中得以研究，如G亚组转运体OsABCG36［43］和 OsABCG43［44］。它们的表达受 Cd胁迫诱导，其中OsABCG36敲除的水稻突变体对Cd的敏感性增加［43］。在本研究中，OsABCG5的表达模式表明它可能参与接种GD17植株对Cd的耐受性。虽然OsABCG5在植物对Cd胁迫应答中的作用还未见报道，但它参与水稻植株的发育以及对其他非生物胁迫的应答［42］。

4 结论

从野生大豆根中分离的根际促生菌Burkholderia sp.GD17可在水稻植株根部有效定殖，并可显著减轻Cd胁迫对植株的伤害。其可能的作用机理包括：降低Cd的根-茎运输、调节抗氧化防卫反应、减缓Cd引发的氧化胁迫伤害和光合作用损伤；促进与Cd吸收、络合、转运、液泡区划等相关基因的表达，从而提高植株对Cd胁迫的耐受性。