家蚕生存素基因在BmN4细胞有丝分裂中的功能分析

张 冰, 王 艺, 李 娜, 李丹丹, 阚云超, 2,*

(1. 南阳师范学院, 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室, 昆虫生物反应器河南省工程实验室, 河南南阳 473061;2. 河南大学生命科学学院, 河南开封 475004)

生存素Survivin/BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing protein 5)是凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis, IAP)蛋白家族中最小的成员。有丝分裂初期，Survivin与纺锤体微管发生特异的受微管动力学调控的可饱和结合反应，G2/M期高表达以抵消凋亡检验点设定，维持细胞凋亡与分裂的平衡(Lietal., 1998)。进一步研究表明Survivin可以通过其单一的杆状病毒IAP重复(baculovirus IAP repeat, BIR)结构域识别第3位苏氨酸(Thr3)磷酸化的组蛋白H3(Thr3 phosphorylated histone H3, H3Thr3ph)，将染色体乘客复合体(chromosomal passenger complex, CPC)定位在着丝粒区，激活着丝粒区的Aurora B激酶活性调控细胞有丝分裂周期(Kellyetal., 2010; Wangetal., 2010; Yamagishietal., 2010)。它也可以通过BIR结构域抑制线粒体途径的细胞凋亡(Mitaetal., 2008)。秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans中含有两个Survivin的同源基因BIR-1和BIR-2，其中BIR-1参与胚胎胞质分裂调控(Fraseretal., 1999)。黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中的Survivin同源蛋白Deterin则是Survivin型IAP组中第一个表现出凋亡抑制活性的无脊椎动物成员，它可以部分回复由反义Survivin处理所造成的HeLa细胞凋亡(Jonesetal., 2000)，此外，Deterin编码序列的BIR结构域可以拯救转染人的caspase-7质粒而死亡的果蝇Kc细胞(Jiangetal., 2001)。最近在赤拟谷盗Triboliumcastaneum中鉴定到了5个IAP的同源基因，功能分析表明iap1和iap5可能作为RNAi介导的害虫防治靶点(Yoonetal., 2020)。

家蚕Bombyxmori是鳞翅目昆虫研究的模式物种，染色体具有小而且数目多、中期形态差异甚微，没有明显的缢痕等特征，是一类弥散型着丝粒(holo-centromere)。易华山等(2017)通过构建瞬时表达载体结合放线菌素D处理证实了家蚕凋亡蛋白抑制因子BmIAP可以明显抑制家蚕的细胞凋亡。Tang等(2014)通过将家蚕的Survivin基因(Bm-svv)构建在昆虫细胞表达载体上结合CCK8检测发现，家蚕Bm-svv在病毒诱导的细胞生长停滞或凋亡中起作用。氮杂丝氨酸诱导的昆虫应激与抗氧化反应中，较高剂量的氮杂丝氨酸处理可以提升Bm-svv的表达从而提高家蚕幼虫存活率(Mandyam and Muthangi, 2020)。目前生存素基因在家蚕中的研究多集中在抑制细胞凋亡方面，关于其调控家蚕细胞周期的报道却非常少，Mon等(2014)在研究CPC在家蚕细胞周期中的功能时发现，与典型的单着丝粒染色体不同，家蚕CPC与染色质介导组装的纺锤体共同定位在前中期染色体的上侧，到中期才形成典型的双取向纺锤体。通过RNAi敲减CPC的任一组分均会使细胞停滞在前中期，染色质介导的纺锤体组装也被破坏。

为了阐明生存素基因在家蚕细胞周期中的功能，我们将其克隆至改建的昆虫表达载体pIZT/V5-His上，并通过融合GFP指示BmSurvivin在细胞周期中的动态定位。作为CPC中的非激酶组分，BmSurvivin过表达之后对激酶组分Aurora B的影响如何尚不清楚。我们通过间接免疫荧光，检测了转染BmSurvivin融合GFP的BmN4细胞中第10位丝氨酸(Ser10)磷酸化的组蛋白H3(Ser10 phosphorylated histone H3, H3Ser10ph)的表达情况，为揭示家蚕生存素基因调控细胞周期的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与细胞

pIZT/V5-His质粒由姚伦广教授惠赠；家蚕卵巢细胞系BmN4由本实验室保存，27℃培养箱中用含10%胎牛血清(Gibco, Invitrogen, 上海)的TC-100昆虫细胞培养基(BBI Life Sciences Corporation, 上海)培养。

1.2 主要试剂

去内毒素质粒抽提试剂盒(美基生物，P1111-03)；反转录试剂盒HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA Remover)，荧光定量PCR试剂盒KAPA SYBR®FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal均购自诺唯赞；Alexa FluorR 594标记的羊抗兔IgG (Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch)荧光二抗购自Abcam，H3Ser10ph的抗体RB7279(P-Ab)由上海吉尔生化有限公司制备(王姣玲等, 2017)。GFP标签抗体(GFP Tag Polyclonal Antibody, 50430-2-AP)和Tubulin内参抗体(Anti-Alpha Tubulin Mouse Monoclonal, 66031-1-Ig)购自武汉三鹰生物技术有限公司。家蚕基因组数据源自NCBI数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)(Suetsuguetal., 2013)。

1.3 BmSurvivin的组织表达

通过在线数据库NCBI搜索家蚕中Survivin的同源基因，发现该基因在家蚕中的同源基因序列号为ADM32525.1，BmSurvivin序列用GeneTool软件设计引物BmSurvivin-RT-F/R(表1)。内参基因是家蚕ActinA3基因，利用GeneTool软件设计引物(表1)。供试家蚕为大造p50品系，幼虫用新鲜桑叶饲养，温度为25±3℃，相对湿度为60%±10%，光周期为12L∶12D。对家蚕5龄第3天幼虫进行组织解剖获得丝腺、中肠、马氏管、精巢、卵巢、脂肪体、皮细胞层和表皮组织，每组织重复取样3次，每样品来自5～20头个体不等，分别用液氮研磨，按照说明书进行RNA抽提。取1 μg RNA通过反转录得到cDNA，利用qRT-PCR检测BmSurvivin在不同组织中的表达量，PCR反应采用KAPA SYBR®FAST qPCR Kit Master Mix(2×) Universal荧光定量PCR试剂盒进行。反应程序: 95℃ 5 min; 95℃ 20 s, 58℃ 20 s, 72℃延伸30 s, 共40个循环。每样品重复测定3次。用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体构建

首先通过CE Design V1.04软件设计引物pIZT-V5-F/R，扩增pIZT/V5-His原始质粒，然后用酶消化模板，转化后测序鉴定将GFP标签成功删除的pIZT/V5-His-zb改建质粒。以pIZT/V5-His-zb改建质粒为模板，利用CE Design V1.04软件设计带有EcoRⅠ和NotⅠ两个酶切位点的引物BmSurvivin-1F/1R和GFP-2F/2R(表1)，分别扩增BmSurvivin和GFP片段，切胶回收产物等量作为模板选择BmSurvivin-1F和GFP-2R作为引物扩增BmSurvivin+GFP融合片段。将融合片段与EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的pIZT/V5-His-zb改建质粒进行重组，转化和测序鉴定阳性克隆，构建pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体。

1.5 细胞转染和BmSurvivin表达检测

当家蚕BmN4细胞在培养瓶中生长到一定密度后，将细胞传至放有12孔圆口盖玻片(爬片，索莱宝)的细胞培养板中。对照质粒pIZT/V5-His(CK)和测序验证无碱基突变的超纯质粒pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP(BG)各0.5 μg与1.5 μL FUGENE转染试剂在减血清的培养基Opti-MEM中孵育15 min，转染BmN4细胞，48 h后进行荧光显微镜(Ob7，ZEISS)观察，统计转染效率。

收集1个12孔板中转染的细胞，提取RNA，超微量分光光度计检测浓度，采用HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA Remover)反转录试剂盒取1 μg合成cDNA第1链，利用qRT-PCR检测BmSurvivin基因的表达，反应条件和反应体系同1.3节。

收集1个6孔板中转染的细胞，利用蛋白提取试剂盒(KGP150, KeyGEN BioTECH)进行总蛋白提取。利用Western blot检测BmSurvivin蛋白表达，GFP标签抗体(GFP Tag Polyclonal Antibody, 50430-2-AP)作为一抗，反应条件和反应体系参考王姣玲等(2017)。

1.6 免疫荧光观察BmSurvivin在BmN4细胞中的周期定位

为了观察BmSurvivin在BmN4细胞中的周期定位，提前1 d对BmN4细胞进行爬片，24 h后将测序验证正确的pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体通过FUGENE转染BmN4细胞，48 h后用4%多聚甲醛室温固定15 min，1×PBS漂洗3次，0.25% Triton X-100透化10 min，1×PBS漂洗3次，3%牛血清蛋白(BSA)室温封闭1 h，1×PBS漂洗3次。H3Ser10ph抗体(1∶200稀释, v/v) 4℃孵育过夜。Alexa FluorR 594标记的羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v) 37℃孵育2 h。最后用0.01 mg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)+90%甘油封片固定。ZEISS激光共聚焦显微镜观察荧光信号。

1.7 数据分析

qRT-PCR扩增结果用内参基因对目的基因进行校正后采用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量，双尾t检验进行统计分析。最后用Excel进行作图。

2 结果

2.1 BmSurvivin在家蚕幼虫不同组织中的表达

qRT-PCR分析表明，BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫的不同组织中表达存在差异(图1)，BmSurvivin基因在家蚕的马氏管中表达量最高，其次是在丝腺和中肠中。在其他组织中也有表达，但是不同组织之间无显著差异(P>0.05)。

图1 BmSurvivin在家蚕5龄第3天幼虫不同组织中的表达谱Fig. 1 Expression profiles of BmSurvivin in different tissues of the day-3 5th instar larvae of Bombyx mori图中数据为平均值±标准误; 柱上不同字母和相同字母分别表示差异显著(P<0.05)和不显著(P>0.05)(双尾t检验)。图3同。Data in the figure are mean±SE. The different letters and same letters above bars indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05)(two-tailed t-test), respectively. The same for Fig. 3.

2.2 pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体

以pIZT/V5-His载体为模板PCR扩增获得GFP基因片段(图2: A)，PCR扩增获得BmSurvivin片段(图2: A)，通过Over-lap PCR扩增获得BmSurvivin+GFP的融合片段(图2: B)并插入pIZT/V5-His-zb的多克隆位点处，酶切验证表明获得pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP(图2: C)。

2.3 BmSurvivin在BmN4中的表达

pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP和对照质粒pIZT/V5-His转染家蚕BmN4细胞48 h后，在荧光显微镜下观察均可以观察到强的绿色荧光(图3: A)，表明BmSurvivin可以与GFP在家蚕BmN4细胞中融合表达；qRT-PCR结果表明，BmSurvivin的mRNA表达水平比对照组显著上调(约169倍)(P<0.05)(图3: B)；Western blot分析表明，对照组有一条约40 kD的GFP与博莱霉素基因融合的条带，实验组有一条约41 kD的GFP与BmSurvivin的融合蛋白条带(图3: C)。

图2 pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体构建Fig. 2 Construction of pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP vectorA: GFP和BmSurvivin的PCR扩增PCR amplification of GFP and BmSurvivin; B: Over-lap PCR扩增BmSurvivin+GFP融合片段Amplification of BmSurvivin+GFP by Over-lap PCR; C: 酶切鉴定pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP载体Identification of pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP by restriction enzyme digestion. 1, 2: GFP的PCR产物PCR products of GFP; 3: BmSurvivin的PCR产物PCR product of BmSurvivin; 4: BmSurvivin+GFP的扩増产物Amplification product of BmSurvivin+GFP; 5: pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP 的酶切消化产物Restriction digestion product of pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP; M: D5000 DNA marker.

图3 pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP转染BmN4细胞48 h后的免疫荧光观察(A)以及qRT-PCR(B)和Western blot (C)检测BmSurvivin的表达Fig. 3 Immunofluorescence observation (A) and the expression detection of BmSurvivin by qRT-PCR (B) and Western blot (C) after transfecion of pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP into BmN4 cells for 48 hM: 蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker; BG: pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP; CK: pIZT/V5-His.

图4 BmSurvivin在BmN4细胞有丝分裂周期中的定位Fig. 4 Localization of BmSurvivin during the mitotic cycle of BmN4 cellsH3Ser10ph: Ser10磷酸化的组蛋白H3 Ser10 phosphorylated histone H3; Merge: 前三图的合并Merge of the former three images. 红色信号为H3Ser10ph抗体，蓝色信号为DAPI染色的染色质。The H3Ser10ph antibody is indicated with red signal, and DAPI-stained chromatin with blue signal. 标尺Scale bar=5 μm.

2.4 BmSurvivin在BmN4中的细胞周期定位

从图4可以看出，在间期核中可以看到明显的GFP信号，涵盖了细胞核和细胞质区域，GFP信号指示BmSurvivin定位在这些区域。随着细胞进入分裂期，GFP信号指示BmSurvivin与染色质共定位，待细胞形成明显的双取向时在纺锤体区域也可以看到GFP的信号，后期随着姐妹染色单体分开，BmSurvivin定位在染色质及胞质分裂区。末期随着两个新的子细胞形成，BmSurvivin仅定位在胞质分裂区。作为有丝分裂指示标记，H3Ser10ph发生在前中期染色质凝缩处，至中期信号最强，与整条染色体重合。后期信号消失。

3 讨论

Survivin是一种进化上比较保守的真核蛋白，与秀丽隐杆线虫不同，我们在家蚕中仅发现了一个同源基因BmSurvivin。组织表达分析结果表明BmSurvivin基因在家蚕5龄第3天幼虫的马氏管中表达量最高，其次是在丝腺和中肠中(图1)。棉铃虫Helicoverpaarmigera的Ha-Survivin在幼虫或蛹成虫期间的血淋巴、脂肪体和中肠中均有转录，在5龄幼虫和蛹中，Ha-Survivin位于中肠上皮细胞以阻止中肠细胞死亡(Heetal., 2012)。此外，所有已知物种的Survivin都在胚胎组织中大量表达，参与胚胎发育过程中的细胞程序性死亡调控(Fraseretal., 1999; Jonesetal., 2000; Verhagenetal., 2001)。

本研究用GFP指示家蚕Survivin的有丝分裂周期定位，发现间期时细胞质和细胞核中均有较一致的绿色信号，随着细胞进入分裂期，BmSurvivin与染色质共定位(图4)，这与已经报道的Survivin着丝粒定位(Jiangetal., 2001)有一定的差异，推测可能是家蚕弥散型着丝粒的结构所致。中期到后期，BmSurvivin与纺锤体微管和染色质共定位，末期随着两个新的子细胞形成，BmSurvivin仅剩余在胞质分裂区。Roth等(2015)利用完整果蝇幼虫大脑中神经细胞的活体成像技术，发现Survivin蛋白从着丝粒动态地重新定位到中央纺锤体，分裂沟以及中体的位置，表明Survivin蛋白是果蝇神经母细胞纺锤体依赖的非对称胞质分裂途径中的关键组分。家蚕BmN4细胞有丝分裂中虽然不存在非对称分裂，但是Survivin同样参与纺锤体微管动态变化和胞质分裂。

通过流式细胞仪分析转染pIZT/V5-His(CK)和pIZT/V5-His-BmSurvivin-GFP(BG)质粒48 h之后的细胞周期变化，发现过表达BmSurvivin会使BmN4细胞的G2/M期比例下降而S期比例上升(未发表结果)。此外，我们还在过表达Survivin的BmN4细胞中发现染色质排列及后期分离异常，未来可以通过统计分析异常细胞的类型及比例深入研究BmSurvivin的功能。该结果为进一步探讨Survivin参与弥散型着丝粒染色体有丝分裂周期调控提供了前期基础。