基于聚刚果红薄膜修饰铅笔芯电极的扑热息痛电化学传感器

畅凯丽，王笑楠，白 宇，洪 福，刘晓军，郑冬云

(中南民族大学生物医学工程学院，武汉 430074； 中南民族大学脑认知国家民委重点实验室，武汉 430074； 医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉 430074)

0 引言

扑热息痛是国际医药市场上最常用的解热镇痛药[1]，副作用较小，又名对乙酰氨基酚，是乙酰苯胺药物中最好的品种，但长期大剂量服用此药会导致一些毒副作用[2]，因此精确检测药物中扑热息痛含量对控制药物质量、保证病人安全是非常必要的。

现有的扑热息痛含量检测方法包括分光光度法、高效液相色谱法、化学发光法、毛细管电泳法及电化学传感法[3]等，其中电化学传感方法因其灵敏度高、线性范围宽、准确性高、响应快速及操作简便等特点而被广泛使用[4]。拟采用此方法，实现对扑热息痛的快速准确检测。

刚果红(Congo Red，CR)是一种常用的酸碱指示剂，分子结构中含有电子给体氨基及多个共轭体系，使其不仅可起到媒介体作用，还具有较好的催化能力[5]。铅笔芯成分主要为石墨与黏土，基于石墨的良好导电性，铅笔芯可被用于制作铅笔芯电极[6]。与传统的玻碳电极、碳糊电极、热解碳电极及碳纤维电极相比，铅笔芯电极具有更好的化学惰性和机械性[7]。与金电极和铂金电极相比，铅笔芯电极具有较宽的适用电位窗口。此外，铅笔芯电极还具有背景电流低、比表面积大、生物相容性良好、制备简易、易于修饰和小型化特点[8]，可广泛应用于电化学传感领域。

采用电聚合法制备聚刚果红薄膜，制备方法简单可控。将铅笔芯电极用作基底电极，操作简单，成本低，便于批量生产。研发的基于聚刚果红薄膜修饰铅笔芯电极的扑热息痛电化学传感器，具有制备简易、成本低、性能好等优点，可快速准确检测药片中扑热息痛的含量，具有良好的生物医学应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司生产)；PHS-3E 型酸度计(上海佑科仪器仪表有限公司子结构中的电子给体氨基及多个共轭体系)；FA2004A型电子分析天平；CL-200型集热式恒温加热磁力搅拌器(金坛市予仪器有限责任公司子结构中的电子给体氨基及多个共轭体系)；日立场发射扫描电镜(SU8010)；铅笔芯(直径为0.5 mm，2B，厂家：TOUCH LINE)及环氧树脂胶(AB胶)均购于本地超市；导电银胶购于深圳市鑫威新材料股份有限公司。

刚果红购自中国远航试剂厂；氯化钾(KCl)购自天津市北联精细化学品开发有限公司；对乙酰氨基酚、无水乙醇、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])及亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6])均购自国药集团化学试剂有限公司。对乙酰氨基酚用无水乙醇配制成浓度为0.1 mol/L的标准溶液，置于4℃的冰箱中保存备用。以上试剂均为分析纯，未经处理直接使用。实验用水均为超纯水。对乙酰氨基酚片(泰诺，每片含主要成分扑热息痛0.65 g)购自周边药店。

1.2 实验方法

1.2.1 铅笔芯裸电极的制备

基于参考文献[9]制备裸铅笔芯电极，简单概括为：铜丝和一小段长2 cm的铅笔芯用导电银胶牢固粘接起来，自然晾干，而后缓慢将其穿入到塑料枪头，用AB胶使枪头两端密封住。将铅笔芯外露出的长度剪裁到5 mm，裸铅笔芯电极(Pencil Graphite Electrode，PGE)制备完成。

使用前，将所制得的裸PGE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]及1 mol/L KCl混合溶液中，在-0.2～+0.8 V电位范围，进行速率为100 mV/s的循环伏安扫描，以检查电极是否漏液，并保证所制得的裸PGE电极面积均几乎相同，为传感器具有良好的重现性提供了基础保证。

1.2.2 聚刚果红薄膜修饰铅笔芯电极的制备

将检验合格的裸PGE放入0.1 mol/L的刚果红水溶液中，在-0.2～+1.6 V的电位区间，循环伏安扫描15圈，扫描速率为100 mV/s，在其表面修饰聚刚果红(poly(congo red)，PCR)薄膜，制得PCR/PGE，则为扑热息痛电化学传感器。

1.2.3 扑热息痛在PCR/PGE上的电化学检测

采用三电极系统作为检测体系，其中，工作电极是裸PGE或PCR/PGE，铂丝(Pt)为对电极，饱和甘汞电极(SCE)是参比电极。检测底液为0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液(PB，pH=4.0)，扫描电位区间0～1.2 V，富集电位0.2 V，富集时间50 s。

2 结果与讨论

2.1 电极表面形貌特征

为探究扑热息痛在PCR/PGE上的电催化机理，运用扫描电镜(SEM)技术表征了不同电极的表面形貌，结果为图1。裸PGE表面呈现典型的石墨片层状结构，较平整(图1A)，但是经过刚果红薄膜修饰后，电极表面变得凹凸不平，呈沟壑状，较疏松与粗糙(图1B)。相比于裸PGE，PCR薄膜的修饰有效增大了电极的表面积，有助于扑热息痛富集在电极表面，使扑热息痛电化学传感器的灵敏度得到提升。此外，作为电子媒介体，PCR还可以加快扑热息痛与电极之间的电子传递速率，催化电极表面上扑热息痛的氧化反应。

图1 裸PGE (A) 和PCR/PGE (B) 的扫描电子显微镜(SEM)图Fig.1 Scanning electron microscope(SEM) images of bare PGE (A) and PCR/PGE (B)

2.2 在不同电极上扑热息痛的电化学响应

采用循环伏安法考察了1.0×10-5mol/L 扑热息痛在裸PGE和PCR/PGE上的电化学响应，结果为图2。扑热息痛的电化学反应为准可逆的过程，在裸PGE上，几乎观察不到电化学响应(曲线a)。在PCR/PGE上，当底液中未添加扑热息痛时，观察不到电化学响应(曲线b)；但当底液中扑热息痛为1.010-5mol/L时，可观察到在0.569 V处氧化峰的峰形尖锐，峰电流为54.60 μA(曲线c)。显然，PCR/PGE对扑热息痛的电化学氧化具有良好的催化作用，可应用在扑热息痛的电化学传感。

图2 裸PGE(a)和PCR/PGE(b, c)在含1.0×10-5 mol/L(a,c)和0 mol/L(b)扑热息痛的0.1 mol/L PB溶液(pH=4.0)中的循环伏安图(扫描速率：100 mV/s)Fig.2 Cyclic voltammograms of bare PGE(a) and PCR/PGE(b,c) in 0.1 mol/L PB buffer solution (pH=4.0) containing 1.0×10-5 mol/L (a,c) and 0 mol/L(b) paracetamol (scan rate:100 mV/s)

2.3 扫描速率对扑热息痛电化学响应的影响

为确认扑热息痛在PCR/PGE上电化学反应的机理，利用线性扫描伏安方法，研究了扑热息痛伏安响应受扫描速率的影响程度，结果为图3A。由图3B可知，在25～375 mV/s的扫描速率区间内，随着扫描速率的增加，扑热息痛在PCR/PGE上的氧化峰电流呈增长趋势，且和扫描速率的平方根具有较好的线性关系：Ip=35.95v1/2-0.96，R=0.994，这说明扑热息痛在PCR/PGE上的电化学氧化反应是一个受扩散控制的过程。由图3C可知，扑热息痛在PCR/PGE上的氧化峰电位与扫描速率的自然对数呈良好的线性关系：Ep=0.022lnv+0.592，R=0.975，结合扑热息痛在PCR/PGE上的电化学氧化是一个可逆的过程，对于受扩散控制且可逆的电化学反应，根据Heyrovsky-Ilkovic方程[10]，如下式所示，计算得扑热息痛在PCR/PGE上电子转移数为：n=1.972≈2，与已有报道[11]一致。

式中为E1/2半峰电位(V)，T为实验温度(K)，R为气体常数(J/(mol*K))，n为转移电子数，F为法拉第常数(C/mol)，IP为峰电流(A)。

2.4 底液pH值对扑热息痛电化学响应的影响

检测底液的pH值不仅会影响扑热息痛在溶液中的荷电状态，还会影响PCR/PGE表面的荷电状态，进而影响扑热息痛与PCR/PGE之间的相互作用，为保证传感器的较高灵敏度，需要对检测底液的pH值进行优化。采用循环伏安法，对扑热息痛在PCR/PGE上，与不同pH值的0.1 mol/L PB缓冲溶液中电化学响应进行了考察，结果图4A所示。

图3 A：以0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液(pH=4.0)为底液，不同的扫描速率(从内到外依次是：25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350和375 mV/s)，5.0×10-4 mol/L扑热息痛在PCR/PGE上的线性扫描伏安图；B：扑热息痛氧化峰电流和扫描速率的线性关系图；C：扑热息痛氧化峰电位和扫描速率自然对数的线性关系图Fig.3 A: Linear scanning voltammograms of 5.0×10-4 mol/L paracetamol on PCR/PGE in 0.1 mol/L PB buffer solution (pH=4.0) at different scan rates (the scan rates from inner to outer are 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350 and 375 mV/s, respectively); B: Linear relationship between the oxidation peak currents and scan rates; C: Linear relationship between the oxidation peak potentials and the common logarithm of scan rate.

图4 A：不同pH值的0.1 mol/LPB溶液中，5×10-4 mol/L扑热息痛在PCR/PGE上的循环伏安图(扫描速率：100 mV/s)；B：扑热息痛氧化峰电流与底液pH值之间的关系；C：扑热息痛氧化峰电位与底液pH值之间的线性关系Fig.4 A: Cyclic voltammograms of 5.0×10-4 mol/L paracetamol on PCR/PGE in 0.1 mol/L PB solution with different pH value；B: Relationship between oxidation peak current of paracetamol and pH value；C: Linear relationship between oxidation peak potential of paracetamol and pH value

由图4A可知，底液pH值会显著影响扑热息痛在PCR/PGE上的电化学反应。当底液的pH值从2.0～10.0逐渐增大时，扑热息痛在PCR/PGE上的氧化峰电流先是逐渐升高，在底液pH值为4.0时，达到最大，之后又开始降低(图4B)。因此，本研究中选择pH为4.0的0.1 mol/L PB溶液作为检测底液。此外，随着底液pH值的升高，扑热息痛其氧化峰电位开始负移，且与pH值之间具有较好的线性关系(图4C)：EP=0.748 3-0.046 7pH(R2=0.996)，表明有质子参与了扑热息痛在PCR/PGE上电化学反应的过程，由关系式Ep=K0.059(m/n)pH(式中K是常数，m是反应中转移质子数，n是转移电子数)可得，当扑热息痛电化学反应在PCR/PGE上发生时，转移的质子数等于电子数。由此可知，扑热息痛在PCR/PGE上电化学反应为一个涉及两质子两电子的准可逆过程。推想其反应方程式为：

2.5 传感器性能评价

2.5.1 传感器的线性范围和检出限

采用方波伏安法，对此电化学传感器的线性范围与检出限进行了考察，其结果如图5A所示，数据分析可知，当扑热息痛的浓度逐渐增大时，在PCR/PGE上，其氧化峰电流也随着增大，且在1.0×10-5～9.0×10-4mol/L浓度，与其浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为Ip=0.50+6.89c，R2=0.996(图5B)。当S/N=3时，可经实验测得传感器的检出限是2.0×10-6mol/L。

2.5.2 重现性

为了进一步对传感器性能进行评价，实验借助循环伏安方法，考察了PCR/PGE稳定性与重现性。放置15 d后，对传感器进行了平行测试，检测信号仍可维持在初始信号的92%，表明传感器的稳定性良好。用一支PCR/PGE对20 μmol/L扑热息痛平行测定8次，相对标准偏差(RSD)为2.0%，如图6A所示；用8支PCR/PGE对20 μmol/L扑热息痛进行平行测定，其相对标准偏差(RSD)为2.7%，如图6B所示，表明传感器的重现性良好。

图5 A：不同浓度的扑热息痛在PCR/PGE上的方波伏安图；B：扑热息痛的氧化峰电流和浓度的线性关系图Fig.5 A: Square wave voltammograms of different concentrations of paracetamol on PCR/PGE；B: Linear relationship between the oxidation peak current of paracetamol and its concentration

图6 A：一支PCR/PGE对20 μmol/L扑热息痛平行测定8次；B：8支PCR/PGE对20 μmol/L扑热息痛进行平行测定Fig.6 A: Parallel determination of 20 μmol/L paracetamol with one PCR/PGE for eight times；B: Parallel determination of 20 μmol/L paracetamol with eight different PCR/PGEs

2.5.3 准确性

取1片对乙酰氨基酚片(标准量0.65 g/tablet)，置于玛瑙研钵中研碎，用无水乙醇充分洗涤并配制成100 mL样品液，借助方波伏安法对其电化学响应进行测定，计算浓度则利用标准曲线法，由算得的浓度计算药片中扑热息痛含量，平行测试6次，利用标准加入法对回收率进行检测，结果如表1所示。6次测定的回收率平均值为101.6%，测得结果与样品扑热息痛的含量接近，表明该传感器具有良好的准确性。

表1 片剂药品分析及回收率测试结果Tab.1 Tablet drug analysis and recovery test results

3 结语

研发了一种操作简单、成本低廉的聚刚果红修饰铅笔芯电极，该修饰电极可显著催化扑热息痛的氧化反应，可用作扑热息痛电化学传感器。传感器表面多孔疏松的结构可实现对扑热息痛的有效富集，从而提高传感器的灵敏度。研究过程中，对扑热息痛电化学传感的检测条件进行了优化，对扑热息痛的电化学传感机理进行了探讨，并对传感器的各项性能指标进行了评价。研发的扑热息痛电化学传感器，其优势在于较宽的线性范围，高灵敏度，良好的重现性及稳定性，具有简易的制备方法，低成本，方便批量生产，可广泛应用在生物医学领域。