磁共振靶向成像检测大鼠纤维化心肌中肌腱蛋白X表达的实验研究

陆文烨 宋梦星 吴芬 夏敏 马占龙

(南京医科大学第一附属医院放射科，江苏 南京 210029)

心力衰竭是一个主要的公共卫生问题，全世界心力衰竭的患病率较高。尽管治疗策略取得了重大进展，但心力衰竭的发病率和死亡率仍很高[1]。心肌纤维化的特征是心肌中细胞外基质蛋白的过多沉积，是几乎所有形式心力衰竭的必要组成部分[2-3]。因此，检测心肌纤维化的发生，对及早发现和治疗心力衰竭起着重要作用[4-6]。心脏磁共振成像作为一种无创评估心肌纤维化的强大工具[7]，检测磁共振T2加权成像(T2 weighted imaging，T2WI)低信号则反映心肌梗死后局部心肌组织的纤维化改变。肌腱蛋白是细胞外基质最大的基底膜糖蛋白家族，肌腱蛋白X(tenascin-X，TNX)是其中表达量最高且促进心肌纤维化的主要结构蛋白[8-9]，促进表皮细胞向间质细胞转化，调节基底膜细胞之间的黏附性。TNX的高表达加快了表皮样细胞向纤维化细胞的转变，促进了心肌的纤维化，进而影响了心肌细胞的血液再灌注及心肌修复[8，10-12]。动态检测心肌纤维化细胞中TNX的表达，对于准确地评估心肌纤维化的发生和发展，促进心血管疾病的防治水平，具有重要的临床价值，是研究心肌纤维化变化的理想特异性靶点。

本研究通过合成anti-TNX-USPIO探针，利用7.0 T磁共振检测TNX在大鼠心肌纤维化细胞中的表达，目的是评估探针靶向检测TNX表达的可行性，探索TNX作为检测靶点是否可行，促进心肌纤维化的在体评估和诊治水平。

1 材料与方法

1.1 心肌纤维化大鼠模型建立

选取36只6周龄无特定病原雄性SD大鼠，体重(225±10)g(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)，分为空白对照组(n=12)、单纯对照组(n=12)和实验组(n=12)。单纯对照组和实验组均皮下注射异丙肾上腺素，每日剂量为5 mg/kg，连续注射7 d；空白对照组皮下注射同等剂量生理盐水，连续注射7 d。大鼠均饲养于无特定病原屏障内，3只/笼，正常饮食饮水，环境温度维持于20～22 ℃，相对湿度为55%～60%。

1.2 anti-TNX-USPIO探针合成及表征分析

选用乙酰丙酮铁作为前驱反应物，溶剂选用二苄醚，选用500 mL三颈烧瓶，依次加入20 mmoL乙酰丙酮铁、100 mL二苄醚和23 mL油酸，调节氮气速率为 130 mL/min，在冷凝回流条件下进行升温，以此合成10 nm级Fe3O4@OA纳米颗粒。采用旋转蒸发法，在Fe3O4@OA纳米颗粒表面修饰DSPE-PEG2000-COOH，制得Fe3O4@OA@PEG纳米颗粒水溶液。于4 mL三氯甲烷中加入150 mg DSPE-mPEG2000和50 mg DSPE-PEG2000-COOH，充分溶解后加入铁含量为10 mg的Fe3O4@OA纳米颗粒，用100 Hz超声充分混合，胶乳去离子水后蒸发10 min获得稳定的Fe3O4@OA@PEG纳米颗粒水溶液。采用一步法偶联抗体制备合成探针，取1 mg Fe3O4@OA@PEG(以Fe计)溶液，加入200 μL多克隆TNX抗体(购自南京凯默尔生物科技中心)，加入100 μL维持电解质溶液(0.01 M，pH=5.5)调节溶液pH至5，加入1.0 mg二氯乙烷进行交联，置于摇床混匀吸附30 min(120 r/min)。反应结束后用磁分离柱纯化游离抗体，纯化后的anti-TNX-USPIO靶向探针再次悬浮于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，4 ℃冰箱保存。

采用透射电子显微镜测定探针粒径，动态光散射分析仪测定探针水和粒径及Zeta电位。在7.0 T磁共振下用不同铁浓度测定T2弛豫率。

1.3 磁共振图像采集及分析

实验组(n=12)注入anti-TNX-USPIO合成探针(剂量为10 mg Fe/kg)，空白对照组(n=12)和单纯对照组(n=12)分别注入同等剂量单纯超微超顺磁性氧化铁(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)，均采用尾静脉注射。三组大鼠分别于打药前及打药10 h后行磁共振成像，比较前后心肌信号强度变化。

心脏磁共振采用7.0 T磁共振扫描仪(Bruker PharmaScans，Germany，南京医科大学磁共振影像实验室)，大鼠线圈，接心电呼吸门控，通过气体麻药量调节心率约300次/min，呼吸频率维持约35次/min。主要参数：视角3 cm×3 cm，矩阵256×256，回波时间 3.5 ms，重复时间130 ms，扫描层厚1 mm，翻转角30 °。

图像扫描完成后，采用Image J软件计算心肌细胞的磁共振成像信号强度，在T2WI序列上每个标本画3个感兴趣区，取其平均值。相对信号强度(relative signal intensity，rSI)定义为同层面心肌信号强度/肌肉信号强度。

1.4 病理学检查

扫描完成后，采用10%水合氯醛过量麻醉处死大鼠(剂量5 mL/kg)，开胸取大鼠心脏标本，用生理盐水及PBS反复冲洗，固定于4%多聚甲醛。常规浸蜡包埋进行冰冻切片，片厚4 μm。光学显微镜下观察心脏组织结构变化。标本分别作苏木精-伊红染色、Masson染色和普鲁士蓝染色，苏木精-伊红染色观察心肌细胞形态，Masson染色观察心肌细胞纤维化情况，普鲁士蓝染色观察心肌细胞内铁颗粒沉积情况。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 anti-TNX-USPIO合成探针的表征分析

靶向TNX抗体的合成探针溶液呈棕色清澈液体，透射电子显微镜下显示探针呈类球形，于PBS中稳定分布，未见明显团聚物形成(图1a)。单纯USPIO的水合粒径为(15.55±0.45)nm，合成探针的水合粒径为(22.89±1.66)nm，二者比较有显著性差异(P=0.002)，表明TNX抗体与USPIO纳米颗粒成功连接。将不同时间点的探针水和动力尺寸分布绘制成图(图1c)，说明合成探针颗粒分散性较好，无明显聚集，保证探针在储存过程中不会发生明显变化。合成前单纯USPIO的Zeta电位为-(46.2±1.38)mV，合成后TNX 抗体探针的Zeta电位为-(22.27±3.61)mV，二者之间差异有统计学意义(P<0.001)，再次证明TNX抗体已成功连接USPIO纳米颗粒。ELISA结果显示TNX合成探针保持较高的生物活性，而单纯USPIO几乎无活性(图1b)。磁共振检测合成探针的T2弛豫效能为193.2 mM-1s-1(图1d和图1e)，表明合成探针具有良好的超顺磁性。

注：图a为合成探针在PBS中均匀分布，图b为ELISA法检测OD450值，图c为不同时间点合成探针的水和动力尺寸分布图，图d和图e为不同铁浓度下检测T2弛豫效能。

2.2 TNX探针靶向心肌纤维化大鼠心脏磁共振成像及信号分析

三组大鼠分别通过尾静脉注入anti-TNX-USPIO(实验组)及单纯 USPIO(单纯对照组和空白对照组)，应用7.0 T磁共振进行前后两次活体成像扫描。探针注入前，空白对照组未见明显心肌异常改变(图2a)，实验组及单纯对照组均显示为T2WI信号减低(图2c和图2e)，实验组及单纯对照组左心室壁厚度[(1.26±0.14)mm]与空白对照组左心室壁厚度[(2.73±0.23)mm]相比有统计学意义(P<0.001)，表明心室壁变薄。空白对照组rSI为2.33±0.59，与实验组及单纯对照组的rSI(1.25±0.11)比较有统计学意义(P<0.001)，表明实验组与单纯对照组心室壁纤维化改变，与既往研究相符，建模成功。

与注入前比较，注入anti-TNX-USPIO 及单纯USPIO后10 h，实验组可见心肌信号强度减低(图2f)，实验组打药后rSI为1.06±0.12，与打药前的rSI(1.21±0.11)比较有统计学意义(P<0.001)；单纯对照组心肌信号强度未见明显减低，打药后rSI为1.30±0.15，与打药前的rSI(1.29±0.11)比较无显著差异性(P=0.783)；空白对照组心肌信号强度未见明显减低(图2b)，打药后rSI为2.17±0.28，与打药前的rSI(2.33±0.59)比较无显著差异性(P=0.240)。结果显示实验组打药前后心肌信号强度明显减低，表明合成探针anti-TNX-USPIO对T2WI信号有明显减低作用。

2.3 病理学检查结果

Masson染色显示单纯对照组和实验组心肌细胞间纤维组织大量增生(图3A-b和图3A-c)，表明心肌纤维化改变，已成功建立心肌纤维化模型。普鲁士蓝染色证实空白对照组心肌细胞内无明显铁颗粒沉积(图3C-a)，单纯对照组心肌细胞内少许铁颗粒沉积(图3C-b)，实验组心肌细胞内见明显铁颗粒沉积(图3C-c)，验证了纤维化心肌细胞中TNX抗体探针的存在。

3 讨论

心肌纤维化是纤维结缔组织对心脏侵害的结果，是指心肌组织中胶原纤维过量沉积、各型胶原比例失调、胶原纤维排列紊乱以及最终导致心脏结构重构(包括心腔扩大、室壁变薄和心肌细胞肥大及凋亡)。在刺激的作用下，血液循环的增加以及心肌促纤维化生长因子和细胞因子水平的升高，均可引发纤维化反应。心肌纤维化形成机制较复杂，心肌纤维化发生在多种促纤维化因子起作用时，存在于心脏的多种细胞类型，促纤维化因子可作为心肌细胞丧失(即修复性纤维化)反应的一部分被激活，也可通过机械和非机械(如神经激素、炎症或代谢)对心脏的应激(即反应性纤维化)被激活[13]。在效应期，这种促纤维化生长因子和细胞因子与它的受体结合，然后触发信号通路和转录因子的激活，在这些激活刺激的响应下，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，导致α-平滑肌肌动蛋白的高表达，从而调节细胞外基质的平衡。心肌纤维化的特征是过量的胶原纤维沉积。胶原纤维沉积可表现为微瘢痕或位于单个心肌细胞和心肌细胞束周围或心肌内血管周围的间质间隙内的大束胶原沉积[14]。使用心脏磁共振或CT测量心肌细胞外体积可检测弥漫性心肌纤维化，心肌细胞外体积能反映胶原纤维沉积的数量。晚期增强心脏磁共振可提供高分辨率的心肌组织表征，识别局部心肌的纤维化瘢痕，间接成为评估纤维化病变的技术[15]。但这些技术难以实现对心肌纤维化的精准检测与评估。

注：空白对照组(图a和图b)与单纯对照组(图c和图d)注入单纯 USPIO以及实验组(图e和图f)注入anti-TNX-USPIO前后对比图像，实验组及单纯对照组与空白对照组比较，左心室壁厚度变薄，心肌信号减低(红色箭头所示)；与注入前比较，实验组心肌信号强度减低，肝实质信号减低(*所示)，空白对照组与单纯对照组无明显改变。

TNX是肌腱蛋白家族中表达量最高的蛋白，它不仅是一种结构蛋白，还可通过调节细胞黏附来显示基质细胞蛋白的特性，其稳定性表达与细胞和组织的结构完整性密切相关，其高表达与血管壁纤维化及钙化相关[7，16-17]。TNX也是信号通路的细胞外调节因子。事实上，TNX已被证明可调节转化生长因子-β的生物利用度和调节上皮细胞的可塑性。TNX的组织分布与肌腱蛋白C的分布往往是相互的，TNX主要参与皮肤组织稳态：限制角化细胞或成纤维细胞的增殖和迁移，而肌腱蛋白C发挥相反的作用：促进细胞分裂和运动[17]。USPIO的靶向成像对炎症作用很有效，因为它直接作用于巨噬细胞[18-20]。利用纳米氧化铁增强磁共振成像，可利用超短回波时间来提高磁共振信号的线性度；高分辨率成像可以结合使用，以提高炎症量化的空间分辨率和敏感性。USPIO可定位炎症细胞浸润的区域[21-23]。磁共振靶向检测USPIO标记的巨噬细胞的可行性已在小鼠心肌梗死研究中得到证实[24]。USPIO具有独特的造影剂特性，可用于靶向心血管成像。USPIO定位于活跃的巨噬细胞浸润区域，并在T2WI上显示为低信号[25-26]。TNX的高表达加快了表皮样细胞向纤维化细胞的转变，促进了心肌的纤维化，进而影响了心肌细胞的血流再灌注及心肌修复。动态检测心肌纤维化细胞中TNX的表达，对于准确地评估心肌纤维化的发生和发展，促进心血管疾病的防治，具有重要的临床价值，是研究心肌纤维化的理想特异性靶点。

注：图A为Masson染色(×400)，空白对照组未见明显纤维化病变(图A-a)，单纯对照组及实验组胶原纤维大量增生(图A-b和图A-c)。图B为苏木精-伊红染色(×400)，空白对照组肌肉细胞形态完整，界限分明(图B-a)；单纯对照组及实验组肌肉细胞浆呈现明显嗜伊红性，横纹消失，组织中有广泛的炎性细胞浸润(图B-b和图B-c)。图C为普鲁士蓝染色(×400)，空白对照组心肌细胞内未见明显铁颗粒沉积(图C-a)，单纯对照组心肌细胞内见少许铁颗粒沉积(图C-b细箭头所示)，实验组心肌细胞内见明显铁颗粒沉积(图C-c细箭头所示)。

本实验在注入探针前后分别扫描，注入探针前，空白对照组未见明显心肌异常，实验组和单纯对照组均显示T2WI信号减低，心室壁变薄，空白对照组的rSI(2.33±0.59)与实验组和单纯对照组的rSI(1.25±0.11)比较有统计学意义(P<0.001)，表明实验组与单纯对照组心室壁纤维化改变，建模成功，符合既往研究结果。探针注入后，实验组可见心肌信号强度减低，实验组打药后rSI为1.06±0.12，与打药前的rSI(1.21±0.11)比较有统计学意义(P<0.001)；单纯对照组及空白对照组心肌信号强度未见明显减低。普鲁士蓝染色证实实验组斑块内可见明显铁颗粒沉积，单纯对照组仅可见少许铁颗粒沉积。大鼠体内磁共振成像结果及病理学实验表明，anti-TNX-USPIO合成探针可作为特异性靶向TNX的分子成像载体，无创和在体检测纤维化心肌内TNX蛋白的分布，可将TNX作为心肌纤维化治疗的特异性靶点，为下一步评估及诊疗提供思路。

本次实验存在一定局限性，选用10 nm级USPIO合成探针所需沉积时间得到缩短，但影响探针到达靶向部位的数量，普鲁士蓝染色图像中显示铁颗粒沉积数量较少，下一步需改进探针合成，优化anti-TNX-USPIO探针靶向成像。

总之，纤维化心肌细胞中存在TNX的表达，anti-TNX-USPIO合成探针可实现大鼠心肌纤维化细胞中TNX内靶向成像的检测目的，也提示TNX有望作为心肌纤维化治疗的特异性靶点，为下一步临床防治心肌纤维化的研究提供新思路。