光疗对于黄疸新生儿肠道菌群及耐药基因的影响分析

张 坤 樊赛男 郑 芳 张佳慧 吴志敏 吕安平 马亚男 方晓慧 张金萍

上海交通大学附属第六人民医院(上海 201306)

新生儿黄疸分生理性和病理性，当未结合胆红素水平过高时，则考虑病理性黄疸，即新生儿高胆红素血症。新生儿高胆红素血症是新生儿时期常见临床问题，是由于体内胆红素生成过多、肝脏摄取和结合胆红素能力不足、肠肝循环增加及胆红素排泄异常等原因所致的胆红素增高，临床表现为黄疸[1]。过高的血清胆红素透过血脑屏障可引起胆红素脑病，若不治疗，会对中枢神经系统造成永久性的损伤[2]。光疗是目前病理性黄疸的最常规疗法，近年来光疗对新生儿的一些近期和远期不良反应也日益被临床医生认识[3-4]，但光疗对于肠道菌群的影响鲜有报道。本研究采用宏基因组测序的方法，研究接受光疗后新生儿肠道菌群的变化，同时分析其菌群携带耐药基因的改变，从菌群的角度揭示光疗对于新生儿肠道的影响，为深入探讨光疗可能造成的不良反应提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2018年6月至2020年6月于上海市第六人民医院接受光疗的住院足月新生儿的临床资料。入选标准：①结合美国儿科协会的标准[5]以及2014 年中国新生儿高胆红素血症诊断和治疗专家共识[6]，生后24 小时内出现黄疸；血清总胆红素值达到相应日龄及相应危险因素下光疗干预标准，或每日上升达到85 μmol/L（5 mg/dL）或每小时＞0.85 μmol/L（0.5 mg/dL）；黄疸退而复现；血清结合胆红素＞3 485 μmol/L（2 mg/dL）。②日龄≤2周。③足月儿，胎龄37～41+6周，出生体质量2 500～3 999 g。④采集标本前后未使用抗生素及微生态制剂；⑤母孕期身体健康，未服用抗生素及微生态制剂；⑥入院前为纯人工喂养患儿；⑦自愿签署知情同意书。排除标准：①胎龄<37 周或≥42 周；②胆红素水平高达换血标准，直接胆红素升高者；③合并肺炎、败血症等疾病者；④有严重免疫缺陷病者；⑤有遗传代谢性疾病者；⑥有先天性胆道畸形或其他脏器畸形者；⑦出生时有严重窒息病史；⑧因喂养不当导致黄疸，如严重体质量下跌超过10%患儿；⑨根据研究者判断，具有中途退组可能者，如监护者具有精神类疾病，生活或工作环境经常变化容易造成失访的情况。

本研究已获得上海市第六人民医院伦理委员会批准（No.2017-004）。所有患儿家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗干预 将患儿置于蓝光治疗箱（XHZ型号，宁波戴维医疗器械股份有限公司），用波长425～475 nm、双面LED蓝光持续式照射，所有患儿均采用连续光疗24 h后休息6～8 h，再继续光疗24 h，然后根据患儿黄疸的变化情况决定是否再继续下一个24 h治疗。

1.2.2 标本留取 留取所有入组的黄疸患儿光疗前、光疗后24 h、光疗后48 h 3个时间点的大便标本（每份标本≥500 mg），留取后立即于－80 ℃条件下冷冻。

1.2.3 宏基因组测序 DNA 提取及检测：参照QIAamp PowerFecal DNA Kit（QIAGEN，德国）说明书进行粪便DNA的提取操作。文库构建及质检：检测合格的DNA 样品用超声波破碎仪随机打断成长度约350 bp的片段，经末端修复、3’端加A、加测序接头、纯化、片段选择、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先用电泳及Nanodrop进行初步定量，再进行Qubit 定量，使用qPCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库上机质量。上机测序：建库质检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混合后进行Illumina HiSeq测序。生物信息分析：测序数据预处理，从各样品质控后再分析读数出发，使用软件宏基因组组装，最后行物种注释及丰度分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0 统计软件对数据进行分析。非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示，两组比较采用Wilcoxon 秩和检验，多组比较采用Kruskal-WallisH检验。菌群丰度的α 多样性比较采用ANOSIM 非参数检验进行分析比较。菌群丰度的β多样性比较采用非度量多维尺度（NMDS）分析，Stress<0.2时，表示NMDS分析结果具有一定的可靠性；Stress<0.05 则认为结果很好；Stress<0.01则认为结果极好。变量间的相关性用Spearman秩相关进行评估。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

参与研究的黄疸新生儿共32 例，所有患儿入院前后均未使用抗生素和益生菌。患儿平均胎龄为（38.0±7.0）周，出生体质量为（3.4±0.6）kg。生后黄疸开始出现时的日龄为2.6（1.9～3.2）天，患儿光疗时的日龄为3.5（2.4～8.9）天，患儿光疗时间为（51.0±15.0）h，入院时经皮测量胆红素值为（21.0±5.0）mg/dL。

2.2 黄疸新生儿接受光疗前后肠道菌群丰度α多样性变化

对黄疸新生儿接受光疗前后组间肠道菌群丰度的差异性进行分析，光疗前、后各组间黄疸新生儿肠道菌群丰度差异无统计学意义（R=－0.003，P=0.526），但光疗48 h有降低的趋势。见图1。

图1 光疗前、后菌群整体菌落丰度α 多样性变化分析

2.3 黄疸新生儿接受光疗前后肠道菌群β多样性分析

采用NMDS 分析对黄疸新生儿接受光疗前后肠道菌群丰度进行排序图分析，发现光疗前后菌群在坐标图上呈现出分散的分布模式，但相似度接近，从纵轴和横轴都很难把3个时间点分开（Stress=0.175），菌群的排序在光疗48 h时也有范围减小的趋势。见图2。

图2 光疗前、后菌群β 多样性分析

2.4 黄疸新生儿接受光疗前后肠道菌种变化分析

患儿光疗前后菌群种水平的相对OUT 丰度柱状图改变见图3。光疗前，光疗后24 h和48 h之间梭状芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜热链球菌、类杆菌、阴沟肠杆菌、巴氏链球菌、不动杆菌属未分类、丙酸棒杆菌、直肠真杆菌、痤疮丙酸杆菌种水平的相对丰度差异均有统计学意义（P<0.05）；随着光疗时间的延长，梭状芽孢杆菌、粪肠球菌、类杆菌、阴沟肠杆菌、巴氏链球菌、不动杆菌属未分类、直肠真杆菌的相对丰度在种水平上呈增加趋势，而丙酸棒杆菌、痤疮丙酸杆菌呈下降趋势。见表1。

表1 黄疸新生儿光疗后肠道菌群相对丰度在种水平的差异性[n=32，M(P25～P75)]

图3 光疗前、后菌群在种水平OUT 物种注释分类

2.5 黄疸新生儿接受光疗前后肠道菌群耐药基因变化

黄疸新生儿接受光疗前检测其肠道菌群携带的耐药基因，发现共有242种耐药基因，其中相对丰度>10的共79种；相对丰度>50的耐药基因共13种，主要为四环素类、β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类耐药基因，同时还发现了较多大肠杆菌耐药基因。

光疗后肠道菌群携带的耐药基因丰度发生显著改变，丰度显著增加的主要耐药基因是β-内酰胺类耐药基因（CTX-M-14）、氨基糖苷类耐药基因（aadA2）、四环素类耐药基因[tet（59）]、外排泵基因（efmA）、喹诺酮类耐药基因（QnrS2）、碳青霉烯酶基因（OXA-347）和磺胺类耐药基因（dfrA 1），差异均有统计学意义（P<0.05）；其中只有金黄色葡萄球菌调节耐药基因（mgrA）光疗后降低（P<0.05）。见表2。

表2 黄疸新生儿光疗后肠道菌群耐药基因变化[n=32，M(P25～P75)]

2.6 黄疸新生儿接受光疗48 h 后肠道菌种与耐药基因的相关性分析

光疗48 h 后，肠道菌群菌种水平的丰度与耐药基因丰度呈显著正相关的有：梭状芽孢杆菌与氨基糖苷类耐药基因[APH(3')-Ia]，单形拟杆菌与β-内酰胺类耐药基因（CfxA 6），阴沟肠杆菌与耐磷霉素基因（UhpT），副血链球菌与大环内脂类耐药基因（mefA）（P<0.01）；呈显著负相关的为，粪肠球菌与氨基糖苷类耐药基因[ANT(2'')-Ia]（P<0.01）。见表3。

表3 光疗48 h后菌种与耐药基因丰度相关性分析

3 讨论

黄疸新生儿接受光疗是临床最常用的治疗措施。目前认为光疗是一种安全、有效和经济的治疗手段。随着对光疗深入的研究，发现光疗可对患儿造成影响，如光疗会造成新生儿发热、腹泻、皮疹、低钙血症及青铜症等一些短期不良反应，但这些不良反应会随着光疗停止而消失。光疗导致超低出生体质量儿病死率增加，及其潜在的临床致癌风险等，引发了对于光疗远期不良反应的思考[7]。本研究从光疗对于肠道菌群的影响方面进行研究，探讨光疗后肠道菌群以及其耐药菌的变化，为深入研究光疗对人体造成的影响提供理论依据。

菌群参与胆红素的代谢[8-9]，主要通过两种途径：一种是直接把排入肠道中的胆红素转化为胆素原，促进胆红素的排泄；另外一种通过菌群间相互作用或者其代谢产物，改变肠道内渗透压和pH 值，抑制β-葡萄糖醛酸苷酶水解结合胆红素，刺激肠道蠕动，加速胆红素的排泄，减轻胆红素的肝肠循环[10]。本研究表明光疗后肠道的部分菌种会发生显著改变，可能会影响到胆红素的代谢。相关研究发现，通过对比粪便菌群混合液与细菌提取纯化物，在转化胆红素的效率实验中，发现粪便菌群混合液转化胆红素效率高，菌群越丰富，对于黄疸的消退越有利[11]。本研究发现，黄疸新生儿接受不同时间的光疗后，菌群的相似度及多样性分析均无显著差异。取样的时间段最长是光疗后48 h，肠道菌群整体丰度的变化小，有下降的趋势，这是否会影响菌群对于胆红素的代谢需要进一步研究。肠道能将结合胆红素转化为粪胆原的菌属有[12-13]：产气荚膜梭菌、艰难梭菌、另支梭菌、脆弱拟杆菌。这些肠道菌群可以通过降低肠道pH值和β-葡萄糖醛酸苷酶活性；参与胆汁酸代谢，调节肝肠循环；增强肝脏的摄取能力等参与胆红素的排泄，降低血清胆红素[14]。菌群改变可显著影响黄疸的消退[15]。从菌种的层面分析，发现随着光疗时间的延长，部分肠道菌种相对丰度显著增多，如拟杆菌，这种菌种的增加有助于加强胆红素的转化。光疗会导致儿童后期的过敏性疾病显著增加，很多过敏性疾病与菌群的紊乱有关[16-17]。本研究也发现光疗后某些菌株如粪肠球菌、阴沟肠杆菌、巴氏链球菌、梭状芽孢杆菌菌种增加，这些增加的菌种对于机体的影响还需要深入探讨。菌群的改变影响机体的功能，菌群携带的耐药基因也会对机体造成显著影响，本研究还发现光疗影响了部分菌种，同时也会影响耐药基因的变化。

研究发现，新生儿在光疗前就携带了大量的耐药基因，随着光疗的变化，部分耐药基因的丰度也发生显著改变。纳入本研究的黄疸新生儿均未用抗生素和益生菌，减少了这些药物的干扰因素。随着光疗时间的延长，光疗后肠道菌群携带的耐药基因丰度发生显著改变，丰度显著增加的主要耐药基因为氨基糖苷类耐药基因（aadA2），四环素基因[tet(59)]，外排泵基因（efmA）、喹诺酮类耐药基因（QnrS2）、碳青霉烯酶基因（OXA-347）、磺胺类耐药基因（dfrA1）等。其中光疗后上升最明显的是β-内酰胺类耐药基因中CTX-M型，是否增加患儿后期对β-内酰胺类抗生素的耐药性，增加抗感染治疗难度等不良后果需要进一步研究[18]。同时，本研究也发现了四环素类抗生素耐药基因，氨基糖苷类耐药基因，这些耐药基因在成人中也普遍存在，目前我们摄入的很多食物中也含有这些类型的抗生素[19]，是否与此有关需要进一步验证。中国人群肠道内相比西方人有更多种类的耐药基因存在，这与抗生素使用种类多和频率高密切相关[20]。肠道是人体最大的消化器官，具有复杂的微生物菌群体系，对人的营养吸收和生理功能有重要影响。随着抗生素的滥用，人体肠道产生了很多不同种类的耐药菌以及耐药基因，这些耐药菌不仅包括正常在肠道内定植的共生菌，也包括一些致病菌，特别是多重耐药致病菌，给临床治疗带来极大挑战[21]。新生儿粪便中大量存在耐药菌和耐药基因[22]，即使未使用抗生素，也能在粪便中检测到多种类的耐药菌，这与本研究结果类似。本研究发现光疗后部分耐药基因丰度会增多，原因可能与菌种的变化有关，但也不排除是因为光疗直接造成的损伤有关[23-24]。

临床使用光疗以降低因胆红素升高造成的脑损伤风险，是目前针对黄疸的一个非常重要的常规治疗手段。随着研究的深入发现了部分不良反应[25]，其中很多原因不明。本研究发现光疗对于机体肠道的的部分菌种影响很大，部分菌种和耐药基因丰度显著增多，可能会导致肠道稳态被破坏，提示任何一项治疗都可能会导致不良反应出现，需要从不同层面深入了解其出现的原因，以助于更好实施临床治疗。

本研究是临床研究对象自身对照，存在以下局限性：黄疸新生儿肠道菌群是光疗治疗前后的自身对照，没有同期的未光疗新生儿对照；没有把肠道菌群随着日龄变化而变化的因素考虑进来；检测到耐药基因，不代表临床耐药，而且目前研究不能区分具体哪一种菌落携带哪一种具体的耐药基因，这需要体外培养等其他实验方法，本次研究没有涉及，需要后期的实验进一步明确。