酸枣仁汤对抑郁模型大鼠海马DKK-1与β-catenin、GSK-3β的影响*

张 浩，孙田昊泽，张 策，刘沐垚，张小芳，王超颖，田旭升

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

抑郁症(depression)又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落、精力下降、劳累负荷重和活动减少为主要临床症状，其发病率、致残率、复发率高且多伴有自杀倾向，是一类严重的精神障碍性疾病。据报道，全球抑郁症患者已达到3亿5千万[1]。该病发生发展与社会、心理因素和生物遗传关系密切，致病机理有多种假说，临床常用选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)与选择性去甲肾上腺素再吸收抑制剂(selective noradrenalin reuptake inhibitors,SNRIs)进行治疗，疗效尚可。目前抑郁症的治疗多采用西药，但不良反应较大[2]。近年来，中医药治疗抑郁的效果与优势逐渐凸显，课题组选用酸枣仁汤治疗虚烦不寐型抑郁症，效果较好。酸枣仁汤出自《金匮要略》，用于治疗“虚劳虚烦不得眠”，为养血安神、清热除烦之经典方剂[3]。

神经可塑性假说认为，情绪脑区神经发生减少和/或神经元退行性变的增加是导致抑郁症发生的关键[4]。临床研究结果显示，与正常人比较，抑郁症患者的海马体积显著减少，且海马神经元出现坏死和萎缩[5，6]，故海马神经元再生障碍是抑郁症发生的重要病理机制之一[7]。研究表明，重组人Dick-kopf相关蛋白-1(dickkopf-1,DKK-1)在一定条件下可以影响神经元、神经胶质细胞以及神经元内信号传导通路；β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在脑组织尤其是海马中呈高表达，参与神经发生、突触可塑性及稳态的调控等过程[8]。本研究建立大鼠慢性不可预见性应激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress,CUMS)，通过观察酸枣仁汤对抑郁模型大鼠海马组织DKK-1、β-catenin与GSK-3β的影响，探讨其抗抑郁机制是否与神经保护作用有关。本研究通过黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号2015121002)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级48只SD雄性大鼠，体质量(180±20) g，购于黑龙江中医药大学动物实验中心，实验动物许可证号SCXK(黑)2014-0008。饲养于室温20～25 ℃、自由摄食饮水、12 h明暗周期环境下适应性循环。

1.2 药物

酸枣仁汤组成：酸枣仁20 g，茯苓10 g，知母10 g，甘草5 g，川芎10 g，其剂量主要参考《金匮要略》，方中所需中药饮片均购于黑龙江中医药大学附属第一医院药局，按照常规方法捣碎浸泡40 min后熬制2次，药液合并过滤，具体换算方法参照参考文献[9]。酸枣仁汤水煎剂人用剂量为55 g / (kg·d)，根据大鼠与人的体表面积换算法得到大鼠服用中剂量为55×0.018×5≈5 g /(kg·d)，此剂量属于临床等效剂量，即酸枣仁汤低、中、高剂量分别为2.5、5、10 g /kg，分别相当于临床等效剂量的1 /2 、1、2 倍。氟西汀(法国礼来苏州制药有限公司，国药准字J20080016，每片20 mg，成人用药剂量20 mg～60 mg)的大鼠临床等效药量为0.04×0.018×5≈0.0036 g/(kg·d)。

1.3 主要试剂及仪器

DKK-1兔抗多克隆抗体(货号AF2056)与二抗(货号A0208)，由上海碧云天生物技术有限公司提供；β-catenin、GSK-3β、β-actin引物均由上海碧云天生物技术有限公司设计并合成。

石蜡切片机(2136型，莱卡)；显微摄影成像系统(moticam3000型，麦克奥迪)；荧光定量PCR仪(7500型，ABI)；高速低温离心机(5810R型，Eppendorf)；自制旷场实验箱(规格100 cm×100 cm×80 cm)。

1.4 分组及模型制备

将48只SD雄性大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、酸枣仁汤低、中、高剂量组及氟西汀组各8只。实验过程中正常组大鼠不接受任何刺激，其余大鼠均单笼饲养，每天从以下7种造模方法中随机选择1种进行造模。造模当天(8∶00～20∶00)进行12 h断食，正常饮水；造模当天(8∶00～20∶00)进行12 h断水，正常饮食；造模当天(8∶00～20∶00)进行12 h鼠笼45°倾斜；向鼠笼中的垫料喷水，保持潮湿状态12 h后更换；造模当天(19∶00至次日7∶00)持续日光灯照射12 h；将大鼠置于0 ℃冷水中，保持大鼠漂浮于水面5 min后捞出，吹风机吹干身体；将大鼠放进45 ℃烘箱内烘烤10 min，造模共持续28 d。采用行为学(糖水偏好实验、旷场实验)实验进行抑郁模型评价。

1.5 给药方法

空白组和模型组大鼠给予 0.9%氯化钠溶液灌胃，酸枣仁汤低、中、高剂量组大鼠分别以相应剂量中药灌胃，氟西汀组给予0.0036 g /kg氟西汀混悬液灌胃，每日1次，共28 d。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 糖水消耗试验 在实验的第0、28天分别进行糖水消耗试验。实验前在安静房间内训练大鼠适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶。第1个24 h 2瓶均装入1%蔗糖水，第2个24 h 1瓶装1%蔗糖水、1瓶装纯水，24 h禁食禁水后开始试验。同时给每只大鼠1瓶1%蔗糖水、1瓶纯水，60 min后取出水瓶定量，并计算各组大鼠的总液体、糖水、纯水消耗量及糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%)。

1.6.2 旷场实验 旷场实验于第28天进行，于大鼠测量体质量后检测，其测试装置为顶部固定有摄像头的100 cm×100 cm×80 cm黑色敞箱，用白色油漆将底部平均分成25个等面积的正方形区域，遮蔽外界视野，降低周围噪音。将大鼠自笼中取出称量后置于清洁敞箱的中央空格，开始计时观察其3 min内的自由活动。其测量方法为水平活动得分以大鼠穿越底面1格(三爪或四爪进入同一格)记1分，垂直活动得分以直立次数1次(大鼠前双足同时离开地面)记1分，每修饰1次记1分[10]。其中水平得分反映动物的活动度，垂直得分反映动物对新异环境探究度，自我修饰得分反映动物对自身的关注度。每只大鼠监测完毕后清理大鼠排泄物，移动痕迹并消除气味，减少其他因素对实验的影响。

1.6.3 免疫组化法检测DKK-1蛋白表达 旷场实验结束后，每组取4只大鼠处死并快速取出海马组织进行石蜡切片，脱蜡进行抗原修复、封闭，加DKK-1一抗(稀释比为1∶100)，4 ℃冰箱保存过夜。PBS洗3次，每次5 min后加二抗，37 ℃温箱30 min。PBS冲洗后加链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC，稀释比为1∶100)，显色剂显色、复染，脱水封片，显微镜下观察。用Motic3000显微摄影系统于200倍下摄片，选用Image-pro plus6.0病理图像分析系统对阳性表达结果进行定量分析，IOD值代表蛋白相对表达量，IOD值=阳性面积×平均光密度。海马CA3区细胞核、细胞质或细胞膜中出现棕黄色颗粒即为DKK-1阳性细胞[11]。每张切片在光镜下随机分析4个高倍镜视野，取其均值代表该片的相对表达量。

1.6.4 荧光定量 PCR检测β-catenin及GSK-3β mRNA 表达 在GenBank上查询到β-catenin及GSK-3β基因序列，利用Primer Premier 7.0软件设计引物(引物序列见表1)。每组取余下的4只大鼠处死并快速取出海马，加入裂解液制备组织匀浆，按20∶1的比例加入Trizol后提取总RNA。将总RNA反转录成cDNA。采用20 μL反应体系，用β-actin作为内参校正，按照Thermo说明书，在96孔板中依次加入Maxima SYBR Green qPCR Master 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 1 μL，Water 7 μL，每个样本均设置3个副孔。反应条件：预变性94 ℃，3 min；变性，94 ℃，30 s；退火，延伸，60 ℃，30 s；共计40个循环。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 行为学实验结果

2.1.1 各组大鼠体质量比较 表2示，与空白组比较，模型组大鼠体质量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，酸枣仁汤中、高剂量组及氟西汀组大鼠体质量均明显增长，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

表2 各组大鼠行为学实验结果比较

2.1.2 各组大鼠糖水消耗实验结果比较 表2示，与正常组比较，模型组大鼠的总液体消耗量、糖水消耗量及糖水偏爱百分比均明显下降(P<0.01)。与模型组比较，酸枣仁汤中剂量组糖水偏爱百分比明显增加(P<0.01)；酸枣仁汤高剂量组与氟西汀组总液体消耗、糖水消耗及糖水偏爱百分比均明显增加(P<0.05,P<0.01)。

2.1.3 各组大鼠旷场实验结果比较 表2示，与空白组比较，模型组大鼠的水平得分、垂直得分和修饰得分均明显减少(P<0.01)；与模型组比较，酸枣仁汤各剂量组及氟西汀组水平得分均明显增加(P<0.05,P<0.01)；酸枣仁汤高剂量组及氟西汀组垂直得分均明显增加(P<0.01,P<0.05)。

2.2 免疫组化染色结果

图1表3示，空白组大鼠海马CA3区中DKK-1蛋白阳性表达较少且呈浅棕黄色。与空白组比较，模型组大鼠海马CA3区中DKK-1蛋白阳性表达明显增加(P<0.01)。与模型组比较，酸枣仁汤各剂量组及氟西汀组大鼠海马CA3区中DKK-1蛋白阳性表达均明显降低(P<0.01)。

图1 各组大鼠海马CA3区DKK-1蛋白表达变化(免疫组化染色，标尺50 μm)

表3 各组大鼠海马CA3区中DKK-1蛋白IOD值比较

2.3 荧光定量PCR法检测海马β-catenin及GSK-3β mRNA表达结果

表4示，与空白组比较，模型组大鼠海马GSK-3β mRNA相对表达量明显下降(P<0.01)；与模型组比较，酸枣仁汤高剂量组大鼠海马β-catenin、GSK-3β mRNA相对表达量均明显升高(P<0.05)。

表4 各组大鼠海马组织β-catenin和GSK-3β比较

3 讨论

结构影像学和病理解剖学研究发现，抑郁症患者会出现海马体积萎缩等现象[12]。Wnt信号通路参与诸多细胞复杂的生化反应，进而调节中枢神经系统，与多种神经精神疾病的发生密切相关。DKK-1、β-catenin及GSK-3β是该通路的3个重要调节因子，可调控细胞增殖、分化以及迁移[13，14]。研究表明，DKK-1表达异常可影响特定通路、环路及相关信号蛋白与基因，临床可出现异常神经发育、障碍性认知和异常情绪等神经精神疾病。DKK-1可阻断Wnt信号在胞内的传递，若下调海马中DKK-1水平，可修复神经细胞并减少细胞凋亡，发挥抗抑郁作用[15]。本研究结果显示，酸枣仁汤可显著降低海马CA3区DKK-1蛋白表达水平，改善抑郁症状。

DKK-1可抑制细胞内GSK-3β活性和下游β-catenin降解，通过降低β-catenin与GSK-3β表达，抑制细胞增殖，从而影响海马神经元的调控。β-catenin与GSK-3β在脑组织尤其是海马呈高表达，并参与神经发生、突触可塑性及稳态形成[8]，海马脑区的β-catenin含量增加与快速产生抗抑郁效应呈正相关[16]。实验结果显示，酸枣仁汤高剂量提高了大鼠海马组织β-catenin基因表达水平，可能通过影响海马结构及功能发挥抗抑郁作用。

若GSK-3β磷酸化水平降低，Wnt信号通路功能紊乱，最终可影响神经元可塑性或导致其凋亡[17]。动物出现抑郁行为，酪氨酸磷酸化GSK-3β的增加与β-catenin水平的显著降低呈负相关[18]，通过上调GSK-3β基因表达水平，可显著改善抑郁症状[19]。实验显示，高剂量酸枣仁汤可提高大鼠海马组织β-catenin与GSK-3β基因表达水平，与上述研究结论一致。

酸枣仁汤在选药上动静相配，酸枣仁养肝血、安心神为君药；川芎调血养肝，茯苓宁心安神为臣药；知母滋阴降火、清热除烦为佐药；甘草和中缓肝为使药，治法上通补并用，有养血调肝、宁心安神、解热除烦之效。中药药理学研究已证实，酸枣仁皂甙、知母总皂苷、茯苓多糖、甘草苷均具有抗抑郁和神经元保护作用[20-22]。本研究通过观察酸枣仁汤干预CUMS模型大鼠海马中上述指标变化，显示出酸枣仁汤具有较好的抗抑郁作用，其作用机制可能与其对海马神经元的保护作用有关。