不同支持物及培养条件对幽门螺杆菌生物膜形成的影响

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，

)是一种螺旋状、微嗜氧、革兰氏阴性杆菌，具有鞭毛，主要寄生于人体胃内

。

可导致急、慢性胃炎，消化性溃疡，胃癌等多种消化道疾病，并且与多种胃外疾病相关。

感染了世界50%以上的人口

，我国成人中

感染率为40%～60%

。

胃炎京都全球共识

中指出，

阳性患者个体是传播的主要宿主，

感染者无制衡因素，均应该根除

。

对抗生素耐药是导致根除治疗失败的主要原因，而生物膜结构的形成是

获得非特异性耐药重要原因

。2006年，Carron等

在内镜及扫描电子显微镜第一次报道在人类的胃黏膜上可以形成

生物膜。

形成生物膜后比浮游细菌具有更强的生存优势，能够逃脱人体的免疫系统，且由于其物理屏障，导致抗生素无法穿透生物膜结构，从而保护膜内细菌。且生物膜内细菌可能由于其营养条件差，增加其突变的可能

。

生物膜内的细菌对抗生素的耐受作用与浮游状态相比高达1 000倍

。因此，干预

生物膜的行程成为解决其对抗生素耐药的出路之一。由于

在胃内多为局灶分布，且动物实验个体较小，定植数量少难以评价其生物膜形态，因而体外环境下生物膜模型的建立更有利于实验工作的开展。本研究通过观察不同培养方式、不同载体条件下

生物膜形态，以探讨更适宜的生物膜体外模型建立方法，为解决临床

耐药提供实验方法。

从表13的“假设方差相等”行读取数值，t值是8.9590，Sig.(双侧)是双尾T检验的显著性概率0.0001，远小于0.05。可以得出结论：高低侧裂缝严重程度有显著差异，表现为较低一侧的裂缝面积大于较高一侧，究其原因，主要是由于向心力，较低一侧的路面所受的荷载作用力更大，路面某点的荷载作用持续时间相对更长(车辆通过弯道的时间一定，而较低侧的路程更短)，而沥青混合料是一种黏弹性材料，在持续荷载作用下易产生塑性变形，久而久之产生裂缝。

1 材料与方法

1.1.1 菌株：

SS1菌株由北京大学第一医院消化内科提供，-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 试剂：哥伦比亚血琼脂(英国OXOID公司)，脑心脊液(英国OXOID公司)，脱纤维羊血(北京宝特英昊科技有限公司)，布鲁氏肉汤(美国BD Difco/BBL公司)，胎牛血清(FBS)(以色列BI公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(以色列BI公司)，4%戊二醛固定液(北京雷根生物技术有限公司)，无水乙醇(生工生物工程股份有限公司，上海)，氯化钠注射液(石家庄四药有限公司)，0.2 μm硝酸纤维素膜(NC膜)(美国通用医疗公司，GE)；甘油(北京索莱宝科技有限公司)，直径15 mm的圆形玻片(无锡耐思生物科技有限公司，NEST)。

图1～2中

SS1为液体培养条件下培养，形态：

SS1成膜形态更为立体，可清晰地看到其鞭毛结构，但其密度较差，生长状态一般；成膜率：液体培养过程中，由于生物膜多分布于气液平面，体外培养时，其成膜率较低。

1.1.3 仪器：压力蒸汽消毒柜(中国上海博讯实业有限公司)，洁净工作台(中国上海博讯实业有限公司)，厌氧罐2.5 L(英国OXOID公司)，隔水式培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，10 μl接种环(山东巴罗克生物科技股份有限公司)，1 μl接种环(北京普利智诚生物技术有限公司)，细菌浊度仪(麦氏浊度计)(北京中慧天成科技有限公司)，JSM-7900F热场发射扫描电子显微镜(日本捷欧路公司)。

1.2.1 菌株复苏、培养及冻存：将

SS1冻存管解冻后取100 μl，使用L棒将菌液均匀涂抹于含质量浓度为80 g/L脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂固体培养基上，于37 ℃微需氧环境下(15% CO

、5% O

、80% NO

)培养72 h，阳性者继续传代培养；将复苏阳性的

SS1使用无菌接种环传至固体培养基上，于上述环境中培养48～72 h；将生长状态良好的

SS1 2～4代使用无菌接种环研磨至冻存液，-80 ℃保存。

1.2.2 构建

生物膜：(1)液体培养及玻片载体：以圆形玻片为载体，将无菌直径15 mm的圆形玻片置于24孔板中，每孔中以500 μl含质量浓度为100 g/L胎牛血清的布鲁氏肉汤作为培养基，加入5 μl预培养的浓度为3×10

cfu/ml的

SS1，24孔板于37 ℃、5% O

、10% CO

、85% N

微需氧环境中振荡培养72 h。(2)固体培养及NC膜载体：以NC膜为载体，将约(1×1) cm

无菌NC膜上置于含质量浓度为80 g/L脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂固体培养基上，将10 μl预培养的浓度为3×10

cfu/ml

SS1均匀涂抹至NC膜上，将琼脂平板置于37 ℃、5% O

、10% CO

、85% N

的微氧环境中培养72 h。

2016年4月，习近平总书记提出：人类是劳动创造的，社会是劳动创造的，劳动没有高低贵贱之分。但同样的劳动者在退休后，退休待遇却相差甚远，有调查数据显示：同样为30年工龄公务员平均退休工资7000元左右，而同一地区的同样工龄的企业人员退休工资2600元左右，退休工资悬殊巨大。有研究指出，我国公务员养老金替代率高达80%～100%，而企业员工的养老金替代率为仅为40%左右。

1.2.3 扫描电镜：采用扫描电子显微镜观察

SS1生物膜模型。样本以无菌PBS冲洗3次后置于4 ℃、2.5%戊二醛中固定2 h，再次使用无菌PBS轻轻冲洗3次。玻片载体的生物膜采用乙醇梯度脱水处理(25%、50%、75%、95%、100%)，NC膜载体的生物膜采用空气干燥的方法，样本干燥后，喷金，扫描电镜观察。

2 结果

讲评时，我采用“兵教兵”与“师教兵”相结合的方式，对于错误率低的题目，由平台随机挑选答对的学生进行讲评，而对于错误率高的题目，由我讲评，进行究因和纠错。讲评完后，我再推送“预习检测”答案解析，让学生深化理解，对于仍不明白的学生可在“提问区”进行提问，课后对提问的学生再给予指导。

2017年6月26日，苏州某地铁线路部分列车在ATO模式下，出现司机界面显示时间不正确，以及在站台停站时间过短的现象。

图3～4中

SS1为固体培养条件下培养，形态：

SS1形态较扁平，但生长状态良好，同样可见其鞭毛结构；成膜率：固体培养过程中，由于

直接接种于NC膜上，生物膜形成于NC膜上，其成膜率较高。

3 讨论

生物膜是一种由存活及凋亡的细菌组成的基质结构，覆盖细菌外的聚合物质有多糖、脂类、核酸和蛋白质等

。细菌生物膜形成包括以下5个环节

：(1)细菌在鞭毛运动下附着、到达表面并粘附；(2)形成覆盖细菌外的聚合物质(多糖、脂类、核酸和蛋白质)；(3)形成早期生物膜结构；(4)形成成熟的生物膜结构；(5)单个细菌从生物膜脱离，处于浮游状态，扩散。细菌生物膜结构的形成会导致临床多种疾病，主要分为以下3种类型

：(1)植入式医疗器械相关生物膜疾病，如留置导尿管引发尿路感染等；(2)体内慢性生物膜疾病，如

感染；(3)细菌形成生物膜导致植入医疗器械发生故障，如假体关节失效等。细菌形成生物膜后，大大增加患者的死亡率、发病率，并导致巨大的经济损失。在临床诊疗中，抗生素治疗通过杀死体内的浮游细菌控制感染，但往往不能根除体内的生物膜细菌

。当抗菌治疗停止时，生物膜内细菌常常再次引发感染导致治疗失败。体外构建

生物膜模型利于进一步研究临床药物对

生物膜结构的破坏作用，从而指导临床用药，降低临床抗生素的耐药率，减轻患者负担。

本研究通过液体、固体培养的方法，以圆形玻片、NC膜为载体，详细介绍了

体外造模方法，并从形态及成膜率两方面介绍区别。实验结果发现，固定培养时选用NC膜为载体，成膜率远远高于液体培养时以圆形玻片为载体，因此，实验中无特殊要求时更推荐固体培养。但在操作过程中要注意以下几点：(1)圆形玻片、NC膜要注意灭菌后使用；(2)NC膜置于含质量浓度为80 g/L脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂固体培养基上时，培养基应未冷却凝固，保证NC膜可吸收含质量浓度为80 g/L脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂液体；(3)PBS冲洗培育成功的生物膜时要轻轻冲洗，以防冲毁生物膜，导致实验失败；(4)接种的菌液浓度为3×10

cfu/ml，不可过浓，否则

营养不足导致生长状态差；(5)NC膜载体的生物膜采用空气干燥的方法，不可使用乙醇梯度脱水的方法，NC膜置于乙醇中会发生皱缩，导致样本被破坏。本文通过介绍不同支持物及条件下

生物膜造模方法，为体外研究

生物膜提供方法依据。

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