邻苯二甲酸二丁酯毒性试验研究*

徐红花, 扆雪涛, 方选, 朱爱民, 于德志

(1.云南省药物研究所，云南 昆明 650111；2.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111；3.青岛市食品药品检验研究院，山东 青岛 266071)

邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)是聚氯乙烯最常用的增塑剂,是一种确定的内分泌干扰素,能引起中枢神经和周围神经系统的功能性变化,然后进一步引起组织上的改变,有趋肝性,并具有中等程度的蓄积作用和轻度刺激作用,同时,可导致大鼠肝细胞损伤,孕期使用还可能引起肾脏相关疾病.在欧美国家已有限制规定[1-7],但我国在化工行业、日常生活用品以及医用材料中还广泛使用DBP.研究通过大鼠90 d灌胃毒性试验,检测邻苯二甲酸二丁酯潜在的毒性,为其机制研究提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

邻苯二甲酸二丁酯,西格玛公司产品(批号：MKBH5622V)；花生油,桶装,山东龙大植物油有限公司产品(生产日期：2013-1-16)；血液生化试剂盒,购自北京利德曼生化股份有限公司.

1.2 仪器

Unicel DxC600全自动生化分析仪,购自Siemens Healthcare Diagnoseics；L500低速自动平衡离心机,购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JJ2000电子天平,购自美国双杰兄弟(集团)有限公司常熟市双杰测试仪器厂.

1.3 实验动物

SD大鼠,雄性,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号：SCXK(京)2012-0001,实验动物使用许可证：SYXK(鲁)2009 0009.

1.4 试验方法

1.4.1 供试品的制备

以花生油作溶剂溶解DPB,分别制成50、200 mg/mL和1 000 mg/mL三个剂量,供试验用.

1.4.2 分组

选取健康雄性大鼠(体质量180～200 g)150只,随机分为5组,每组30只.分别为空白对照组(蒸馏水)、溶剂对照组(花生油10 mg/kg)、DBP低剂量组(50 mg/kg)、DBP中剂量组(200 mg/kg)和DBP高剂量组(1 000 mg/kg).

1.4.3 给药

以10 mL/kg的体积灌胃,每天1次,连续90 d.

1.4.4 检查项目和频率

每天给药后观察动物一般体征,于灌胃给药的第30天、第60天和第90天分别测量体质量和摄食量后,每组抽取10只动物麻醉处死,解剖后称量主要脏器,并于第90天腹主动脉取血测定血液生化指标.

1.4.5 检查指标

①一般体征：主要观察记录动物外观体征、行为活动、精神、呼吸和胃肠道反应等情况.②体质量和摄食：灌胃给药的第30天、第60天和第90天分别测量体质量和摄食量.③血液生化指标：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、肌酸磷酸激酶(CK)、总胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG).④脏器质量：称量解剖后动物的脑、心、肝、肾、肾上腺、胸腺、胰、肺、睾丸和附睾的质量,计算睾丸和附睾的脏器系数.

1.5 统计方法

用IBM SPSS Statistics 24软件进行统计分析；对满足正态分布、方差齐和方差分析检验结果显著的数据,采用LSD检验,非正态分布或方差不齐数据,采用Kruskal-Wallis H检验,并对检验结果显著的数据进行两两比较；自身对照比较采用配对T检验和两个相关样本检验.

2 结果

2.1 一般观察

给药期间,DBP低、中、高剂量组动物在给药1周后,逐渐出现活动减少和竖毛的症状,高剂量组表现最明显,此外各组动物未见其他明显的全身毒性反应.

2.2 体质量

DBP高剂量组大鼠体质量给药60 d与空白对照组和溶剂对照组比较有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05)，给药90 d明显低于空白对照组(P<0.01)，其余各组比较无显著差异，见表1.

表1 DBP 90 d灌胃对大鼠体质量的影响

2.3 摄食

低、中、高剂量组大鼠摄食量给药60 d与空白对照组和溶剂对照组比较有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05)；给药90 d DBP高剂量组摄食量明显低于空白对照组(P<0.01)和溶剂对照组(P<0.05)，其余各组比较无显著差异(见表2).

表2 DBP 90 d灌胃对大鼠摄食量的影响

2.4 脏器质量

2.4.1 对大鼠睾丸质量和睾丸系数的影响

DBP高剂量组大鼠灌胃90 d解剖后,肉眼可见睾丸与空白对照组比较明显缩小(图1),其质量与其他组比较明显降低,且低于同组30 d和60 d时的睾丸质量,统计有显著性差异(P<0.01)；DBP高剂量组灌胃30 d和60 d睾丸质量与其他各组比较有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05)，结果见表3.

DBP高剂量组大鼠灌胃90 d睾丸系数与其他组比较明显降低,组间比较有显著性差异(P<0.01)；高剂量组大鼠灌胃90 d睾丸系数与同组灌胃30 d和60 d睾丸系数比较明显降低(P<0.01).其他各组未见统计学差异(表4).

表3 DBP 90 d灌胃对大鼠睾丸重量的影响

表4 DBP 90 d灌胃对大鼠睾丸系数的影响

2.4.2 对大鼠附睾质量和附睾系数的影响

DBP高剂量组大鼠灌胃90 d解剖后,肉眼可见附睾与空白对照组比较明显缩小(图1),其质量与其他组比较明显降低(P<0.01)；DBP高剂量组大鼠灌胃90 d时附睾质量与同组灌胃30 d和60 d比较有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05，表5).

DBP高剂量组大鼠灌胃90 d时附睾系数与其他组以及与同组灌胃30 d和60 d比较均有降低趋势,但均无统计学差异(P>0.05，表6).

表5 DBP 90 d灌胃对大鼠附睾质量的影响

表6 DBP 90天灌胃对大鼠附睾系数的影响

(a)空白对照组大鼠睾丸和附睾解剖后外观图 (b)DBP高剂量组大鼠睾丸和附睾解剖后外观图

2.4.3 对其他脏器质量的影响

DBP经90 d灌胃,对大鼠脑、心、肝、肾、肾上腺、胸腺、胰和肺的脏器质量无影响(见表7).

表7 DBP 90 d灌胃对大鼠脏器质量的影响

2.5 对大鼠血液生化指标的影响

DBP高剂量组碱性磷酸酶和肌酐浓度高于溶剂对照组,天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素和肌酸激酶浓度低于空白对照组,DBP低、中、高剂量组甘油三酯低于空白和溶剂对照组,DBP低、高剂量组总胆固醇低于溶剂对照组,组间比较分别有显著性差异(P<0.01),详细结果见表8.

表8 DBP 90 d灌胃对大鼠血液生化指标的影响

3 讨论

在90 d给药的过程中,随给药天数的增加,给药组大鼠外观状态明显较差,其中DBP高剂量组动物最明显.这与其体质量、摄食、脏器质量及系数以及血液生化检测结果吻合.在解剖时肉眼可见睾丸和附睾的萎缩及变形,表明DBP对生殖系统的危害明显；另外,多项血液生化指标的明显改变表明DBP在一定剂量下会导致大鼠代谢的紊乱以及诱发多系统、多功能的脏器损伤,因未进行组织病理学检查,故可能导致损伤的脏器，以及损伤的严重程度还需进一步研究.

虽一般认为AST的降低并没有临床意义,但就本研究来看,DBP会导致多种酶的明显变化；同时文献资料表明,AST的降低与维生素B6和锌的缺乏有密切的关系[8],大鼠的相关研究也表明,维生素B6的缺乏可以导致生殖系统功能的破坏,而锌元素则大量存在于男性睾丸中,参与精子生成、成熟和获能等整个过程[9].因此,对于DBP是否会影响机体维生素B6和锌等元素代谢,并由此引起生殖系统损伤有待进一步研究.