郁件康,周良*,龚银华*,卞金磊
(1.苏州大学附属第一医院,江苏 苏州 215006;2.中国药科大学,江苏 南京 211198)
吲哚胺-2,3-双加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase 1,IDO1)在免疫耐受中发挥着重要作用,近年来被认为是小分子肿瘤免疫疗法的新靶点[1]。IDO1是人体内必需氨基酸色氨酸(Trp)代谢的关键限速酶,在多种肿瘤组织中过度表达[2]。肿瘤组织中过度表达的IDO1致使肿瘤微环境中Trp耗竭,以此抑制T细胞的增殖分化,从而抑制免疫系统对肿瘤的免疫应答。研究表明联用IDO1抑制剂,不但可以增强常规化学疗法的疗效,同时能与放射疗法产生协同作用[3]。此外,研究表明ido1基因敲除的小鼠能健康地存活,这说明使用IDO1抑制剂不会产生严重的基于机制的副作用。因此,新型IDO1抑制剂的研究和开发对于肿瘤的治疗具有重要的意义。
自2006年,报道了首个IDO1与4-苯基咪唑(PIM)的共晶复合结构(PDB代码:2D0T)后,到目前已有数十个不同配体的IDO1共晶复合结构先后被报道。这些晶体结构的解析为计算机辅助药物设计(CADD)的方法发现潜在的IDO1抑制剂铺奠定了基础。尽管已有多种IDO1抑制剂被报道,然而到目前为止仍未有药物成功上市。目前在研的IDO1抑制剂中,其骨架主要集中在[5,6]-稠合杂芳族类衍生物、羟脒类衍生物、苯基咪唑类衍生物、醌类衍生物、苯基脲类衍生物和苯基苯磺酰肼类衍生物等6种结构类型上(见图1)[4-7]。
图1 处于临床研究的IDO1小分子抑制剂
为获得结构新颖具有良好类药性性质的IDO1抑制剂,前期运用虚拟筛选与活性评价相结合的方法从32个结构各异的化合物中获得苗头化合物LVS-019[8]。基于LVS-019在IDO1酶催化口袋中的结合模式,本研究从占据口袋A的部分、连接链部分和占据口袋 B的部分3个方面设计并合成3个系列共23个衍生物。希望基于前期虚拟筛选出的苗头化合物LVS-019与IDO1的结合模式,及其他类已报道的IDO1抑制剂的构效关系,对苗头化合物LVS-019进行合理结构改造[9],并对设计合成得到的一系列具有新型骨架结构的小分子化合物进行IDO1抑制活性的初步筛选[10]。同时,通过探索我们希望能为IDO1抑制剂的研究提供新的思路,为今后新型骨架结构的发现与活性较好的IDO1抑制剂的开发提供线索。
1.1 化合物的设计 前期为获得新型骨架的IDO1抑制剂,采用相似性搜索与分子对接相结合的方法发现了一系列结构各异的化合物,同时对这筛选得到的化合物进行IDO1酶抑制活性测定和基于HeLa细胞的IDO1抑制实验,得到一个含有氰基吡啶结构的新型IDO1抑制剂LVS-019[8]。运用分子对接软件将LVS-019与IDO1(PDB代码:4PK5)研究LVS-019在IDO1蛋白活性口袋中的结合模式(见图2)。可以发现:①吡啶环位于A口袋中,6位异丙基部分与A口袋中周围氨基酸残基形成疏水相互作用,氰基与IDO1活性位点中的亚铁血红素配位;②硫乙酰胺连接链控制末端苯环部分延伸至B口袋;③末端苯环与氨基酸残基Phe226形成π-π堆叠作用。
图2 LVS-019与IDO1活性位点关键氨基酸残基分析
综上所述,本论文基于LVS-019在IDO1活性口袋中的作用模式,拟在A部分引入不同取代的氰基吡啶环和不同取代的喹啉环、连接链部分引入多种环状片段、B部分引入不同取代基进行化合物设计,探索各部分对IDO1抑制活性的影响(见图3)。
1.2 化合物的合成 化合物的合成如图4所示。首先,以2-氯-3-腈基吡啶与新戊酸为原料,通过Menisci反应得到中间体4a。同时,以4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯与取代酰氯为原料,通过缩合反应得到中间体2,随后脱除Boc保护得到关键中间体3。中间体3与2-氯-3-氰基吡啶(4a)发生取代反应得到终产物6a~6e(结构见表1)。具体合成过程参考实验部分,所有终产物都经过核磁与质谱确证。
(i)AgNO3,(NH4)2S2O8,H2SO4,0 ℃ to rt;(ii)CH2Cl2,0 ℃ to rt;(iii)HCl,EtOAc,rt;(iv)Et3N,DMF,80 ℃
根据文献报道,可采用如CCK-8法来测定抗肿瘤增殖活性获取IC50值。考虑研究实际,目前通过检测在不同浓度的IDO1抑制剂作用下产生的色氨酸代谢物犬尿氨酸的吸光度计算得到各个IDO1抑制剂的IC50值,进而对其进行初步的IDO1抑制活性评价。其中化合物6a~6c和6e的活性与LVS-019相比有1.2~3倍的提高。将连接链延长一个碳原子长度合成的化合物6e的IDO1抑制活性优于6a~6d,与LVS-019相比活性提高了3倍左右。将6b~6d进行结构和活性的对比,发现在末端苯环对位引入氯原子的IDO1抑制活性较引入氟原子或溴原子提高2倍左右。
通过以上工作我们对构效关系进行初步总结:①连接链部分为环己烯乙酰胺时,有利于IDO1抑制活性的提高,但引入氮杂环或缩短、增加连接链的长度会使IDO1抑制活性有不同程度的下降;②B部分为芳香环时,IDO1抑制活性保持;当B部分为苯环时,苯环上引入单卤素取代基特别是氯原子取代时,有利于IDO1抑制活性的提高。
基于较好的体外IDO酶综合抑制结果,我们选取具有代表性的化合物6e进行了理化性质考察及成药性评价来进一步验证改造方向的合理性(见表2)。我们测试了并计算了化合物的水溶性(S)、透膜性(Caco-2透膜实验)、极性表面积(polar surface area,PSA)。如表2所示,化合物6e在水溶性上与先导化合物LVS-019相比有了6倍左右的提高。在随后的Caco-2透膜性实验中,化合物表现出了中等的水平(Papp A-B2.94× 10-6cm·s-1),且无明显的外排作用,但就透膜作用来说具有良好的成药性。
表2 代表性化合物6e理化性质与成药性考察
随后我们对6e进行了初步药代动力学(Pharmacokinetic,PK)评价,结果如表3所示。整体来看,代表化合物6e相比于LVS-019来说均显著提高的PK性质。静脉给药途径中(iv,15 mg·kg-1),化合物6e半衰期为1.66 h,AUC为1 902 ng·mL-1·h。在口服给药途径中(po,50 mg·kg-1),化合物6e半衰期为1.91 h,口服生物利用度[F(%)]达到31%。化合物LVS-019则表现出了较快的清除率,以及随之的较短保留时间(po t1/2=0.34 h)。总体来说,代表化合物6e的初步体内药代动力学实验呈现出良好的成药性,显示出代表化合物作为口服药物具有一定潜力,值得进一步研究。
表3 代表化合物6e初步PK考察
4.1 仪器与试药 本文涉及的化学合成所使用的试剂(除特殊说明外)均为市场上销售的化学纯或分析纯产品,不经处理直接使用。化合物纯化所使用的薄层层析板采用青岛海浪硅胶干燥剂厂生产的硅胶GF254薄层板,柱层析硅胶采用青岛海浪硅胶干燥剂厂生产的100~200目或200~300目硅胶。未经特殊说明,本文所使用的柱层析方法为湿法装柱、干法上样,洗脱剂的比例为体积比,所使用的石油醚沸程为60~90 ℃。
化合物结构确证所使用的仪器包括:Nicolet Impact 410 型(KBr压片)红外测定仪、GC-MS-QP2010型质谱仪、Agilent technologies 6520 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS高分辨质谱仪、AV-300 BRUKER核磁共振仪、X-4数字显示显微熔点测定仪。
4.2 化合物6a~6g的合成
4.2.1 4-(4-硝基苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2a)的制备 将1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中,于0 ℃下逐滴滴加对硝基苯甲酰氯(2.04 g,10.98 mmol,1.1 eq),滴加完毕后,室温下搅拌5 h,TLC检测反应完全。后处理:反应液用1 mol·L-1稀盐酸溶液洗涤一次,水洗涤一次,再用饱和氯化钠溶液洗涤一次后,有机相减压蒸除溶剂得2a(2.74 g,78.5%),为白色固体。HRMS(m/z):C17H23N3O5计算值350.171 0,(M+H)+,实际值350.171 5。
4.2.2 4-硝基-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3a)的制备 2a(2.00 g,5.72 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中,于室温下通入干燥的氯化氢气体,反应过夜,TLC检测反应完全。后处理:将反应液抽滤,滤饼干燥得3a(1.35 g,82.5%),为白色固体。HRMS(m/z):C12H15N3O3计算值250.118 6,(M+H)+,实际值250.119 3。
4.2.3 4-(4-氟苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2b)的制备 将1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中,于0 ℃下逐滴滴加对氟苯甲酰氯(1.74 g,10.98 mmol,1.1 eq),滴加完毕后,室温下搅拌5 h,TLC检测反应完全。后处理:反应液用1 mol·L-1稀盐酸溶液洗涤一次,水洗涤一次,再用饱和氯化钠溶液洗涤一次后,有机相减压蒸除溶剂得2b(2.73 g,84.9%),为白色固体。HRMS(m/z):C17H23FN2O3计算值323.176 5,(M+H)+,实际值323.176 9。
4.2.4 4-氟-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3b)的制备 将2h(2.00 g,6.20 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中,于室温下通入干燥的氯化氢气体,反应过夜,TLC检测反应完全。后处理:将反应液抽滤,滤饼干燥得3b(1.42 g,88.5%),为白色固体。HRMS(m/z):C12H15FN2O计算值223.124 1,(M+H)+,实际值223.124 2。
4.2.5 4-(4-氯苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2c)的制备 将1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中,于0 ℃下逐滴滴加对氯苯甲酰氯(1.92 g,10.98 mmol,1.1 eq),滴加完毕后,室温下搅拌5 h,TLC检测反应完全。后处理:反应液用1 mol·L-1稀盐酸溶液洗涤一次,水洗涤一次,再用饱和氯化钠溶液洗涤一次后,有机相减压蒸除溶剂得2c(2.88 g,85.1%),为白色固体。HRMS(m/z):C17H23ClN2O3计算值339.147 0,(M+H)+,实际值339.147 3。
4.2.6 4-氯-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3c)的制备 将2i(2.00 g,5.90 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中,于室温下通入干燥的氯化氢气体,反应过夜,TLC检测反应完全。后处理:将反应液抽滤,滤饼干燥得3c(1.47 g,90.4%),为白色固体。HRMS(m/z):C12H15ClN2O计算值239.094 6,(M+H)+,实际值239.095 5。
4.2.7 4-(4-溴苯甲酰氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(2d)的制备 将1-Boc-4-氨基哌啶(2.00 g,9.99 mmol,1 eq)溶解于20 mL的二氯甲烷中,于0 ℃下逐滴滴加对溴苯甲酰氯(2.41 g,10.98 mmol,1.1 eq),滴加完毕后,室温下搅拌5 h,TLC检测反应完全。后处理:反应液用1 mol·L-1稀盐酸溶液洗涤一次,水洗涤一次,再用饱和氯化钠溶液洗涤一次后,有机相减压蒸除溶剂得2d(3.21 g,83.9%),为白色固体。HRMS(m/z):C17H23BrN2O3计算值383.096 5,(M+H)+,实际值383.096 5。
4.2.8 4-溴-N-(哌啶-4-)苯甲酰胺(3e)的制备 将2j(2.00 g,5.21 mmol,1 eq)溶解于20 mL 的乙酸乙酯中,于室温下通入干燥的氯化氢气体,反应过夜,TLC检测反应完全。后处理:将反应液抽滤,滤饼干燥得3e(1.54 g,92.3%),为白色固体。HRMS(m/z):C12H15BrN2O计算值283.044 1,(M+H)+,实际值283.044 4。
4.2.9N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-硝基苯甲酰胺(6a)的制备 将4a(0.33 g,1.70 mmol,1 eq)、3a(0.53 g,1.86 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.38 g,3.72 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中,于80 ℃下反应5 h,TLC检测反应完全。后处理:将反应液倒入水中,抽滤,滤饼柱层析得6a(0.52 g,75.3%),为淡黄色固体。m.p.127~129 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:8.31(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),7.95(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),7.72(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),6.82(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),6.16-6.13(m,1H,-NH-),4.46-4.34(m,2H,-N-CH-),4.31-4.28(m,1H,-CH-),3.25-3.17(m,2H,-N-CH-),2.24-2.19(m,2H,-CH-),1.72-1.63(m,2H,-CH-),1.30(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.2,164.4,159.1,149.0,143.3,139.7,127.7,123.2,118.1,109.4,90.9,47.3,46.8,37.7,31.4,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25N5O3计算值 408.203 0,(M+H)+,实际值408.201 8。
4.2.10N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-氟苯甲酰胺(6b)的制备 将4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3b(0.47 g,1.80 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.36 g,3.60 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中,于80 ℃下反应5 h,TLC检测反应完全。后处理:将反应液倒入水中,抽滤,滤饼柱层析得6b(0.39 g,62.6%),为淡黄色固体。m.p.136~138 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.80-7.75(dd,J=9.0 Hz,J=6.0 Hz,2H,Ar-H),7.69(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),7.14-7.09(m,2H,Ar-H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),5.97(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.41(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.27-4.25(m,1H,-CH-),3.19(t,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),2.18(d,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.67-1.63(m,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.8,165.3,162.5,159.1,143.3,130.3,128.8,128.7,118.2,115.1,114.9,109.2,90.9,46.9,46.7,37.7,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25FN4O 计算值381.208 5,(M+H)+,实际值381.209 6.
4.2.11N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-氯苯甲酰胺(6c)的制备 将4a(0.34 g,1.75 mmol,1 eq)、3c(0.53 g,1.92 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.39 g,3.84 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中,于80 ℃下反应5 h,TLC检测反应完全。后处理:将反应液倒入水中,抽滤,滤饼柱层析得6c(0.36 g,51.6%),为淡黄色固体。m.p.153~155 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.72-7.68(m,3H,Ar-H),7.41(d,J=9.0 Hz,2H,Ar-H),6.79(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),5.98(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.43-4.38(d,J=15.0 Hz,2H,-N-CH-),4.31-4.21(m,1H,-CH-),3.24-3.14(m,2H,-N-CH-),2.20-2.15(dd,J=12.0 Hz,J=3.0 Hz,2H,-CH-),1.68-1.63(m,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.3,159.1,143.3,132.4,128.2,127.9,121.7,118.1,109.3,90.9,46.9,46.7,37.7,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25ClN4O计算值397.179 0,(M+H)+,实际值397.179 6。
4.2.12N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-)哌啶-4-基)-4-溴苯甲酰胺(6d)的制备 将4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3d(0.58 g,1.81 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.37 g,3.62 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中,于80 ℃下反应5 h,TLC检测反应完全。后处理:将反应液倒入水中,抽滤,滤饼柱层析得6d(0.33 g,45.5%),为淡黄色固体。m.p.188~190 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.70(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),7.65-7.56(dd,J=12.0 Hz,J=9.0 Hz,4H,Ar-H),6.80(d,J=6.0 Hz,1H,Ar-H),5.99(d,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.41(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.27-4.26(m,1H,-CH-),3.23-3.15(m,2H,-N-CH-),2.17(d,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.72-1.60(q,J=12.0 Hz,2H,-CH-),1.31(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.1,165.3,159.1,143.3,132.9,131.3,128.0,125.6,118.1,109.3,90.9,46.9,46.7,37.3,31.6,29.1 ppm;HRMS(m/z):C22H25BrN4O计算值441.128 5,(M+H)+,实际值441.128 8。
4.2.13N-(1-(6-(叔丁基)-3-氰基吡啶-2-基)哌啶-4-基)-2-苯基乙酰胺(6e)的制备 将4a(0.32 g,1.64 mmol,1 eq)、3e(0.46 g,1.81 mmol,1.1 eq)和三乙胺(0.37 g,3.62 mmol,2.2 eq)溶解于DMF中,于80 ℃下反应5 h,TLC检测反应完全。后处理:将反应液倒入水中,抽滤,滤饼柱层析得6e(0.33 g,53.3%),为淡黄色固体。m.p.138~140 ℃。1H-NMR(300 MHz,CDCl3-d6),δ:7.67(d,J=9.0 Hz,1H,Ar-H),7.38-7.28(m,5H,Ar-H),5.32(t,J=6.0 Hz,1H,-NH-),4.29(d,J=12.0 Hz,2H,-N-CH-),4.13-4.00(m,1H,-CH-),3.60(s,2H,-CH2-),3.16-3.07(m,2H,-N-CH-),2.03-1.98(m,2H,-CH-),1.49-1.40(m,2H,-CH-),1.30(s,9H,-CH3)ppm;13C-NMR(75 MHz,CDCl3-d6),δ:172.0,169.8,159.0,143.3,134.3,128.8,128.5,126.8,118.1,109.1,90.7,46.5,46.3,43.4,37.6,31.4,29.1 ppm;HRMS(m/z):C23H28N4O计算值377.233 6,(M+H)+,实际值 377.234 0。
本文基于前期研究获得的具有氰基吡啶结构的IDO1抑制剂LVS-019,该化合物在IDO1酶抑制活性测定和基于HeLa细胞的IDO1抑制实验中测得其具有良好的IDO1抑制活性,且在MTT比色法测定细胞毒性实验中LVS-019对HeLa细胞的毒性远小于Epacadostat。我们运用分子对接软件将LVS-019与IDO1(PDB代码:4PK5)进行分子对接观察LVS-019在IDO1蛋白活性口袋中的结合模式。基于LVS-019在IDO1活性口袋中的占据情况,设计并合成一系列衍生物,其结构经HRMS和NMR确证。并得到初步构效关系:①连接链部分为环己烯乙酰胺时,有利于IDO1抑制活性的提高,但引入氮杂环或缩短、增加连接链的长度会使IDO1抑制活性有不同程度的下降;②B部分为芳香环时,IDO1抑制活性保持;当B部分为苯环时,苯环上引入单卤素取代基特别是氯原子取代时,有利于IDO1抑制活性的提高。其中最优化合物6e表现出良好的药代性质,具有成为口服抗肿瘤药物的潜力。本论文的研究希望能为后期IDO1抑制剂的结构修饰与改造提供理论依据。