苯磺隆对抗除草剂甘蓝型油菜K4的杀雄效果

吕慧杰，王红梅，赵天天，张东锁，郭 媛，胡胜武

(西北农林科技大学 农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100)

油菜是中国乃至世界重要的油料作物，是人类食用植物油的重要来源，也是动物饲料中蛋白质的重要来源。大力发展油菜产业对于中国食用植物油安全供给，增加菜农收入，实现乡村振兴战略具有非常重要的意义[1]。油菜杂种优势显著，目前利用油菜杂种优势的主要途径包括细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育(GMS)、生态型雄性不育(Ecological male sterility,EMS)、化学杂交剂诱导的雄性不育(CIMS)和自交不亲和(SI)等[2-3]。其中，CIMS具有亲本选配自由、后代无胞质不良效应、育种周期短、杂交种在生产上不会出现不育株，甚至还可以利用F2代等优点[4]，受到中国广大油菜育种工作者的青睐。中国油菜科研人员在新型化学杂交剂的筛选、研发及两系杂交种育种方面做了大量工作。目前，国内外公开报道的适用于油菜的化学杂交剂或其有效成分主要有杀雄剂1号[5]、KMS-1[6]、ESP[7]、EN[8]、SX-1[9]、苯磺隆(tribenuron methyl, TBM)[10-13]、化杀灵WP[14]、单嘧磺酯钠(monosulphuronester sodium)[15]、胺磺隆(amidosulfuron)[16]等。其中，TBM属于磺酰脲类化学除草剂，低浓度使用时对甘蓝型油菜等数十种十字花科植物杀雄效果良好，是一种高效的油菜化学杂交剂成分[11-12,17-18]。目前，利用该技术已经育成‘湘杂油’‘渝黄’‘秦优’‘陕油’等系列油菜杂交种，并在生产中广泛推广利用[4,17]。

在利用化学杂交剂进行油菜两系杂交种制种时，当给母本喷施化学杂交剂时，一般要对父本进行遮挡，以保证父本花朵安全，以便产生大量可育花粉。然而，遮挡过程增加了劳动力投入，使制种成本提高。因此，利用抗除草剂(TBM)的油菜突变体作为父本，无需遮挡，可以简化油菜两系杂交种制种程序，对油菜杂种优势的利用及实际生产具有重要意义[19]。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase,ALS)基因发生突变是油菜对TBM产生抗性的原因，目前利用自然突变、化学诱变或基因编辑技术已获得若干油菜ALS基因突变体，例如PM1和M9 (S653A in BnALS1)、PM2 和M342(T574L in BnALS3)、PN19(T574L in BnALS1)、5N(T574L in BnALS1和BnALS3)、M45(P197S/L in BnALS3)、K4(P197S in BnALS3)和K5(P197S in BnALS1)等[20-28]。Li等[19]在抽薹期对油菜突变体M45及其野生型HS5喷施0.05 mg/L TBM，发现HS5植株生长及育性受到严重影响，而突变体M45植株未受到影响，且花粉完全可育。然而，关于抽薹期喷施不同剂量(浓度)TBM对油菜ALS基因突变材料生长发育的影响，以及诱导其雄性不育的TBM剂量的研究鲜有报道。西北农林科技大学油菜研究中心生物技术育种课题组(以下称本课题组)研究发现，在抽薹期叶面喷施20.00 mg/L TBM，可诱导甘蓝型油菜抗除草剂突变体K5完全雄性不育，而野生型ZS9则在喷施0.10 mg/L TBM时就完全雄性不育[20]。K5的BnALS1基因的544位点处碱基由C突变为T (BnALS1544T)，导致BnALS1蛋白的182位由Pro突变为Ser[29]。

甘蓝型油菜抗除草剂突变体K4，是本课题组利用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变甘蓝型油菜ZS9，得到的另一个抗除草剂TBM的突变体[30]。研究表明，该突变体BnALS3基因535位由C突变为T(BnALS3535T)，导致其编码的BnALS3蛋白179位Pro变为Ser[25]。本研究以甘蓝型油菜突变体K4为材料，通过抽薹期喷施不同浓度TBM，观察TBM处理对K4的花粉育性、花器官形态以及主要农艺性状的影响，从而明确诱导油菜突变体K4雄性不育的TBM剂量。研究结果将为抗除草剂油菜在化学杀雄两系杂交种育种中的有效利用提供骨干材料及理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料及化学药剂

供试材料为甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)抗TBM突变体K4及其野生型ZS9。该突变体是ZS9经过EMS诱变的M2代群体，喷施TBM筛选得到[30]；其BnALS3基因535位由C突变为T(BnALS3535T)，导致其编码的BnALS3蛋白179位Pro突变为Ser(对应拟南芥AtALS-197位)[25]。

化学杂交剂由苯磺隆(TBM)配置而成。TBM可湿性粉剂，有效成分含量10%(麦发牌，沈阳市和田化工有限公司)。取1 g TBM溶于500 mL水，配制成2.00 mg/mL的母液，喷药前将母液稀释成不同浓度的工作液，对照用纯水。

1.2 试验方法

田间试验于2018年─2020年2个生长季节进行。2018年和2019年9月下旬将材料播种于陕西杨凌西北农林科技大学农作物标本园 (N34.29°，E108.06°)，小区种植，行长2 m，行距0.2 m，株距0.1 m。一般大田管理。

1.2.1 喷药处理 于油菜抽薹期，最大花蕾长度1～2 mm时，对K4与ZS9植株进行喷药处理。 2 a试验分别于2019-03-14、2020-03-03第1次对材料进行叶面喷施，单株受药量约6 mL，7 d后进行第2次喷施。其中，K4设0.00 mg/L(对照)、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L共设7个TBM浓度处理，ZS9设0.00 mg/L(对照)、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L共4个TBM浓度处理。田间试验每个处理设3次重复，每个重复5行，采用随机区组设计。

1.2.2 花器官观察 在盛花期各浓度处理小区中，随机选择10株，每株选取主花序的5朵花，对花瓣长、花瓣宽、雄蕊长度和雌蕊长度进行测定，并对花和花序进行拍照记录。

1.2.3 育性统计 不育花粉率统计：在花期取不同浓度处理后的K4和ZS9的花蕾放入70%酒精保存，每个浓度处理选3个花蕾，剥开花药压碎混匀，用醋酸洋红压片染色，在显微镜(Olympus BX51，日本)下检测花粉活力并拍照，统计不育花粉与总花粉数，计算不育花粉率。

不育株率统计：将植株上有连续5朵以上雄性不育花的植株定义为雄性不育株，统计不育株数与小区内植株总数，计算不育株率。

1.2.4 农艺性状考察 在油菜成熟期，各处理小区内随机选择10株，测定以下农艺性状：株高、分枝部位、一次有效分枝数、主花序长度、主花序角果数、全株角果数、每果粒数、角果长度、千粒质量和单株产量。

1.3 数据处理

利用Excel 2010对试验数据进行整理，SPSS 19.0对数据进行统计分析，差异显著性分析使用Duncan’s法，P<0.05。表中数据为“平均值±标准偏差”。

2 结果与分析

2.1 不同浓度TBM处理对突变体K4花器官及育性的影响

为探明诱导突变体K4雄性不育的TBM剂量范围，抽薹期利用不同浓度的TBM对K4和其野生型ZS9进行叶面喷施处理。结果表明，ZS9随着TBM处理浓度的升高，花茎变紫色(图1- A1～D1)，花器官(花瓣长、花瓣宽、雌蕊长、雄蕊长)变小(表1；图1-A2～D2)，花粉不育率(表2；图1-A3～D3)及雄性不育株率升高(表2；图1- A4～D4)，其中，0.10 mg/L TBM处理可诱导ZS9完全雄性不育。K4随着TBM处理浓度的升高，花茎略微变色(图2-A1～G1)，花器官(花瓣长、花瓣宽、雌蕊长、雄蕊长)变小(表3；图2- A2～G2)，花粉不育率(表4；图2-A3～G3)及雄性不育株率升高(表4；图2-A4～G4)，在10.00 mg/L TBM处理下可诱导K4完全雄性不育。

表1 不同浓度苯磺隆处理下ZS9花器官形态Table 1 Floral organ morphology of ZS9 under different concentrations of tribenuron methyl

A～D分别代表TBM处理浓度为0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.50 mg/L;1～4分别代表花序、花、花粉活力、自交结实情况A-D represents 0.00 mg/L, 0.05 mg/L, 0.10 mg/L and 0.50 mg/L of TBM treatment，respectivelyt; 1-4 represents inflorescence, flower, pollen vigor and bagged seed-settings，respectively

表2 不同浓度苯磺隆处理下ZS9的育性情况Table 2 Male sterility of ZS9 induced by different concentrations of tribenuron methyl

A～G分别代表TBM处理浓度为0.00 mg/L、1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、7.50 mg/L、10.00 mg/L和12.50 mg/L;1～4分别代表花序、花、花活力自交结实情况A-G represent 0.00 mg/L,1.00 mg/L,2.50 mg/L,5.00 mg/L,7.50 mg/L,10.00 mg/L,12.50 mg/L of TBM treatment,respectively;1-4 represents inflorescence,flower,pollen vigor and bagged seed-settings,respectively图2 不同浓度苯磺隆处理下突变体K4花器官、花粉活力及自交结实情况Fig.2 Morphology of floral organs, pollen viability and bagged seed-setting of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表3 不同浓度苯磺隆处理下K4花器官形态Table 3 Floral organ morphology of K4 under different concentrations of tribenuron methyl

表4 不同浓度苯磺隆处理下K4突变体的育性情况Table 4 Male sterility of mutant K4 induced by different concentrations of tribenuron methyl

与ZS9比较，K4能耐受更高浓度的TBM。在不同浓度TBM处理后，K4花茎变色较ZS9更轻微，花粉不育率和雄性不育株率升高慢，诱导K4完全雄性不育的TBM浓度(10.00 mg/L)是ZS9(0.10 mg/L)的100倍。

2.2 不同浓度TBM处理对K4农艺性状的影响

ZS9在不同浓度TBM喷药处理后，与对照比较，除角粒数显著降低外，单株产量、千粒质量和全株角果数等其他9个性状无显著差异(表5)。

表5 不同浓度苯磺隆处理下ZS9主要农艺性状Table 5 Main agronomic traits of ZS9 underdifferent concentrations of tribenuron methyl TBM

K4在不同浓度TBM处理后，除分枝数、主花序长度、全株角果数与对照比较无显著差异外，其他7个性状均存在显著差异(表6)。角果长度在1.00 mg/L TBM处理下，与对照比较就已显著减小；角粒数在5.00 mg/L TBM处理下，与对照比较出现显著降低；主花序角果数则在10.00 mg/L TBM处理下，与对照比较存在显著差异；株高、分枝部位、千粒质量、单株产量则在12.50 mg/L TBM处理下，与对照比较存在显著差异，且均比对照显著降低。在诱导K4完全雄性不育的10.00 mg/L TBM处理下，除主花序角果数、角果长度、每角粒数与对照相比显著降低外，单株产量等其他7个性状与对照均无显著差异。

表6 不同浓度苯磺隆处理下K4主要农艺性状Table 6 Main agronomic traits of mutant K4 under different concentrations of tribenuron methyl TBM

3 讨 论

利用化学杂交剂诱导雄性不育已成为油菜杂种优势利用的一个重要授粉控制系统[3-4]。在利用化学杂交剂进行油菜两系杂交种制种时，当给母本喷施化学杂交剂时，一般要对父本进行遮挡，以保证父本安全、花粉可育，这个过程将增加制种成本。中国科研人员研究发现，磺酰脲类化学除草剂TBM在低浓度使用时，对甘蓝型油菜等多种十字花科植物具有良好的杀雄效果，是一种高效的油菜化学杂交剂成分[11-13,17-18,31]。有学者提出，利用抗化杀剂(TBM)的油菜作为父本，喷药时父本无需遮挡，从而可以简化两系杂交种制种程序[19]。本研究以抗TBM的甘蓝型油菜突变体K4为材料，在抽薹期叶面喷施不同浓度的TBM，研究其诱导雄性不育的效果，探究诱导K4雄性不育的最适TBM浓度。结果表明，在0.10 mg/L×6 mL TBM剂量处理下，野生型ZS9就已经产生100%雄性不育，主要农艺性状未受显著影响，这与前人结果基本一致[11-12,19-20]；而 10.00 mg/L×6 mL TBM剂量处理才能诱导K4完全雄性不育，该TBM剂量是诱导ZS9雄性不育剂量的100倍。Lv等[20]研究报道，在20.00 mg/L×5 mL TBM处理才能诱导抗除草剂突变体K5雄性不育，该剂量大约是诱导K4雄性不育剂量的两倍。诱导K4和K5雄性不育TBM剂量差异的原因可能是二者突变基因不同。K4的BnALS3基因的535位点处碱基由C突变为T(BnALS3535T)，导致BnALS3蛋白的179位由Pro突变为Ser[25,32]；K5的BnALS1基因的544位点处碱基由C突变为T(BnALS1544T)，导致BnALS1蛋白的182位由Pro突变为Ser，虽然这两个突变位点均对应拟南芥的AtALS-197位。Guo等[26]研究报道，甘蓝型油菜EMS突变体M342(T574L in BnALS3)和PN19(T574L in BnALS1)突变位点均对应拟南芥的AtALS-574位，但二者对除草剂TBM和MES(mesosulfuron)苗期抗性也存在差异。因此，推测突变基因以及突变位点的不同可能会造成突变体对杀雄剂的抗性不同。

此外，研究发现外施TBM导致油菜花茎变色等现象，下一步测量相关激素如花青素等的含量变化，雄蕊败育的细胞学特征，以及基因表达变化情况等，以期揭示苯磺隆诱导油菜ALS基因突变体雄性不育的机理。总之，K4是一个很好的抗化杀剂(TBM)的亲本材料，在两系制种中作为父本材料使用可简化制种程序，降低制种成本。该研究结果为油菜化杀两系育种提供了重要的理论参考和育种亲本材料。