基于CD157的四色法流式细胞术单核细胞和中性粒细胞PNH克隆检测方法的建立及评价

洪 俊，饶永彩

（1.武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060；2.武汉生物制品所，湖北 武汉 430060）

阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一种罕见的获得性造血干细胞疾病，由X连锁磷脂酰肌醇聚糖A类（phosphatidylinositol glycan-class A，PIG-A）基因的体细胞突变引起；该突变导致部分或完全不能生物合成糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）锚定蛋白；PNH的临床特征主要有血管内溶血、骨髓发育不良和异常部位形成血栓风险升高[1-2]。1996年以来，流式细胞术已成为检测GPI缺陷细胞的首选方法[3]。2010年，国际临床细胞计量学会发布了第1个通过流式细胞仪诊断和监测PNH的指南[4]，Sutherland等于2012年发表了后续实用指南[5]，阐述了PNH中性粒细胞和单核细胞高灵敏度检测的详细方案和分析策略，PNH中性粒细胞和单核细胞测定均采用基于荧光Aerolysin的方法——FLAER法。FLAER是Alexa-488标记的无活性气单胞菌溶素前体的变异体，可以直接结合白细胞上所有GPI连接结构的GPI部分，大量研究结果表明，FLAER法是检测PNH和相关疾病中GPI缺陷白细胞最为可靠的方法[4-6]。

腺苷二磷酸-核糖基环化酶2（CD157）是由骨髓基质细胞抗原-1基因编码的GPI锚定细胞表面酶。有研究结果表明，CD157可能具备与FLAER类似的潜在PNH克隆检测性能[11-12]。由于FLAER非常稀少，且价格昂贵，如何采用流式细胞仪快速、经济地检测PNH中性粒细胞和单核细胞PNH克隆，是当前困扰流式细胞术PNH检测更广泛开展的一个难题。目前，四色流式细胞术在我国的使用最广泛，建立可与FLAER法媲美的非FLAER四色法流式细胞术PNH克隆检测法，显然对于我国PNH克隆检测具有更现实的意义。本研究基于CD157、CD14、CD33、CD15、CD24建立非FLAER法的PNH四色流式测定方案（简称CD157流式法），并验证CD157用于PNH克隆检测的可行性，以寻找FLAER法PNH克隆检测的替代方法。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2014年1月—2018年9月武汉大学人民医院45例PNH患者外周血样本，采用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）稀释，获得中性粒细胞和单核细胞大克隆（＞40%）、中等克隆（1%～40%）、小克隆（＜1%）的PNH克隆。PNH诊断标准参照文献[1]。因目前PNH相关指南和专家共识中均没有将PNH基因检测结果纳入PNH诊断依据，所以本研究中的病例均未进行相关基因检测。本研究经武汉大学伦理委员会批准。

1.2 流式细胞术检测

流式细胞术检测样本处理具体方法参考文献[8]，将100 μL充分混合的乙二胺四乙酸抗凝外周血与适量预滴定的MoAb在室温下避光孵育30 min。室温避光条件下，用2 mL稀释至1×的新鲜氯化铵溶液裂解红细胞10 min，然后采用含1%牛血清白蛋白的PBS洗涤白细胞2次，在获得之前重悬于0.5～1.0 mL PBS。采用FACS Canto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）及配套试剂进行检测，数据分析采用FACS-Diva软件。检测前，对于初始设置和光电倍增管进行优化，使用在不改变光电倍增管的情况下获得的单染色补偿管生成计算机辅助补偿矩阵。使用CST校准微球校准流式细胞仪的电压及增益。每个样品测定管至少取200 000个细胞。采用Boolean设门策略分析白细胞，CD157流式法用FSC/SSC、CD45、CD15、CD157和CD24分析中性粒细胞PNH克隆，用FSC/SSC、CD45、CD33、CD157和CD14分析单核细胞PNH克隆；CD55/CD59流式法用FSC / SSC、CD45 、CD55、CD59和CD24用于分析中性粒细胞PNH克隆，使用FSC / SSC，CD45、CD55、CD59和CD14用于分析单核细胞PNH克隆；FLAER法参照文献[15]进行操作。采用FACS Canto Ⅱ流式细胞仪检测以下荧光标记单克隆抗体组合：CD14-APC-cy7、CD33-APC、CD157-FITC、CD15-APC、CD24-PE、CD45-PECy7、FLAER-Alexa 488（Cedarlane）、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7、CD14-PE、CD64-PECy5和CD45-PECy7，每个样本重复测定3次，取均值。

1.3 CD157流式法精密度评估

1.3.1 批内精密度 对中性粒细胞和单核细胞PNH大、中、小克隆连续重复测定3次，计算、s和变异系数（coefficient of variation，CV）。

1.3.2 批间精密度 在24 h内对中性粒细胞和单核细胞PNH大、中、小克隆进行10次单独检测(仪器断电、重新校准)，计算、s和CV。

1.4 统计学方法

采用线性回归和Pearson相关分析评价不同流式检测方法批内和批间测定结果的相关性，以P＜0.01为差异有统计学意义。采用Wilcoxon秩检验进行配对样本比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。通过Bland-Altman分析评估2种方法检测性能的一致性，以平均偏差为零表示2种方法绝对性能一致。率的比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD157流式法PNH中性粒细胞和单核细胞检测结果

CD157流式法PNH中性粒细胞和单核细胞检测结果见图1。

图1 CD157流式法中性粒细胞、单核细胞PNH克隆流式散点图

2.2 批内、批间精密度

（1）批内精密度。对于PNH大克隆，中性粒细胞和单核细胞的CV分别为0.07%、0.28%；对于PNH中等克隆，中性粒细胞，单核细胞的CV分别为0.71%和0.78%；对于PNH小克隆，中性粒细胞和单核细胞的CV分别为3.01%和4.95%。见表1。

表1 批内精密度 %

（2）批间精密度。在24 h内对所有PNH克隆进行连续10次的单独分析运行测定（仪器断电和重新校准）。对于PNH大克隆，中性粒细胞和单核细胞的CV分别为0.19%和0.27%；对于PNH中等克隆，中性粒细胞，单核细胞的CV分别为1.30%和2.84%；对于PNH小克隆，中性粒细胞和单核细胞的CV分别为7.19%和7.98%。见表2。

表2 批间精密度 %

2.3 CD157流式法和FLAER法单核细胞、中性粒细胞检测结果相关性和一致性分析

采用CD157流式法和FLAER法[11-12]对45份PNH患者的外周血样本进行平行分析。PNH中性粒细胞的线性回归分析结果显示，2种方法相关性良好[Y=0.98X-0.058（r2=0.998）]。Wilcoxon秩检验结果显示，2种方法检测结果差异无统计学意义（P＞0.05）；Bland-Altman分析结果显示，2种方法的一致性较好（平均偏差为0.13%）。PNH单核细胞的线性回归分析结果显示，2种方法相关性良好[Y=0.99X+0.089（r2=0.996）]。Wilcoxon秩检验结果显示，2种方法检测结果差异无统计学意义（P＞0.05）；Bland-Altman分析结果显示，2种方法一致性较好（平均偏差为0.07%）。见图2、表3。

表3 CD157流式法和FLAER法对45份PNH克隆样本的分析数据 %

图2 CD157流式法与FLAER法的相关性和一致性分析结果

2.4 3种流式细胞检测方法诊断PNH的效能

对CD157流式法、FLAER法和CD55/CD59流式法诊断PNH的效能进行比较，结果显示，CD157流式法和FLAER法诊断PNH的效能优于CD55/CD59流式法。见表4。

表4 3种流式法诊断PNH的效能

3 讨论

有研究结果显示，35%的PNH患者在诊断后5年内因相关并发症死亡[1]。对骨髓衰竭患者进行早期PNH克隆检测可能会影响治疗决策和结果，出现PNH微小克隆通常预示患者对免疫抑制疗法反应良好[2]。因此，有效检测GPI缺陷细胞是诊断PNH和治疗骨髓衰竭的关键。

SUTHERLAND等[5]制定了利用特定试剂测定PNH的标准化程序，以及PNH中性粒细胞和单核细胞高灵敏度检测的详细方案和分析策略。该方案基于荧光Aerolysin（FLAER）的方法，包括针对中性粒细胞的FLAERAlexa488、CD24-PE、CD15-PECy5、CD45-PECy7和针对单核细胞的FLAERAlexa488、CD14-PE、CD64-PECy5、CD45-PECy7。有多中心研究结果显示，基于2管/四色流式细胞检测中性粒细胞和单核细胞PNH克隆的FLAER法是通过流式细胞术验证和标准化PNH测定的良好基础[7-9]。毫无疑问，FLAER法是GPI缺陷型中性粒细胞和单核细胞的高灵敏度检测方法[4-9，11-14]。然而，作为近年来新开发的流式细胞检测非单克隆抗体试剂，FLAER的产量非常少，目前全球仅1家公司生产，且价格高昂。因此，如何采用流式细胞仪快速和经济地检测中性粒细胞和单核细胞PNH克隆，是当前PNH流式细胞术检测更广泛开展面临的难题。

CD157是由骨髓基质细胞抗原-1基因编码的GPI锚定细胞表面酶，主要在前B细胞生长中发挥作用[10]。在造血系统内，CD157在正常中性粒细胞和单核细胞上高表达[15]。有研究结果表明，CD157可能具备与FLAER类似的潜在PNH克隆检测性能[11-12]。本研究参考相关指南[4-5，13-14]，使用CD24、CD15、CD45、CD157（中性粒细胞）和CD14、CD33、CD157（单核细胞）建立了基于CD157的非FLAER法流式细胞术PNH检测方案，并与经典的FLAER法进行了比较。结果显示，CD157流式法与FLAER法中性粒细胞、单核细胞PNH克隆的检测结果差异均无统计学意义（P＞0.05）；2种方法的相关性良好（r2＞0.99），一致性良好（中性粒细胞和单核细胞PNH克隆的平均偏差分别为0.13%、0.07%）；CD157流式法的批内和批间精密度分别低于5%和8%，检测单核细胞PNH克隆的批内、批间精密度均高于检测中性粒细胞PNH克隆；这可能与单核细胞数量较少，获得性事件显著少于中性粒细胞而具有更多的异质性结果有关。本研究还发现，CD157流式法和FLAER法诊断PNH的敏感性均为100%，高于CD55/CD59流式法（94.0%）。

综上所述，基于CD157的中性粒细胞和单核细胞PNH克隆检测方法具有良好的检测性能，CD157流式法检测结果与FLAER法一致性良好，基于CD157的非FLAER法可以作为无法使用FLAER法的实验室进行PNH克隆检测的替代方案。