咸味肽的制备技术研究进展

张康逸，屈凌波，温青玉，张雨，董彩虹

(1.河南省农业科学院农副产品加工研究中心，郑州 450002；2.河南省全谷物小麦制品加工国际联合实验室，郑州 450002；3.河南省全谷物鲜食加工工程技术研究中心，郑州 450002；4.郑州大学 化学与分子工程学院，郑州 450001；5.河南省安康食品科技研究院，郑州 450006；6.河南省安康未来食品科技有限公司，郑州 450040；7.中北大学 化学工程与技术学院，太原 038507)

咸味是一种非常重要的基本味，它在食品调味中是不可或缺的，是咸味食品的重要枢纽[1]，俗称“百味之王”，是调制各种复合风味的基础。但随着食盐摄入量的增加，居民的营养状况和健康水平持续下降。据报道，人体过多摄入食盐会增加患心脏病、高血压等疾病的风险[2]。

为了降低患高血压、心血管等疾病的风险，在国家提倡全民减盐低钠的同时，许多非钠盐类替代物、咸味肽、咸味增强肽、风味改良剂等食盐替代物不断涌现在市场上[3]，非钠盐类替代物与食盐的性质最为接近，但只能降低一部分食品中的含钠量，且存在应用上的局限性，使得其在市场上的应用存在一定的限制。风味改良剂在市场上的应用较为广泛，能起到减盐不减咸、减盐不减鲜、修饰异味和增加风味的作用，但在营养方面存在一定的局限性。而咸味肽不失为一种健康营养的食盐替代物[4]，可以通过酶水解或氨基酸合成得到，不仅能提供咸味，而且能补充人体所需氨基酸。因此，咸味肽的开发具有很大的市场价值，且对于需低钠食品的特殊群体来说，咸味肽产品更是有着巨大的潜在利用价值。

目前，对于咸味肽的研究，其呈味机理、构效关系、制备技术以及应用成为当今社会的研究热点之一[5]。为了能更好地开发出健康营养的咸味肽，对咸味肽的研究进展进行归纳总结，以期为促进咸味肽的深入机理研究和产品研发提供理论依据和参考。

1 咸味肽的研究必要性及结构特点

1.1 咸味肽研究必要性

世界卫生组织对食盐的摄入量提出以下建议，即人均日摄入量应不超过6 g，而我国的人均日摄入量已达12 g，超过建议食盐摄入量的2倍[6]，且研究结果表明较高的钠离子摄取量与高血压、心血管疾病等有直接的关系[7]，因此开发出既能保证咸味，避免口味上的不足，又能降低钠离子摄入的咸味肽是必要的，也是未来开发食盐替代物的必然趋势。1984年，Tada等[8]在酪蛋白水解物中首次发现咸味二肽Orn-β-Ala的咸味强度与NaCl相当，2008年，Zhu等[9]在无盐酱油的研究中提取了3种咸味肽，氨基酸序列分别为Ala-Phe、Phe-Ile、Ile-Phe。彭增起等[10]通过对大豆蛋白进行酶解、分离纯化，得到一种纯净的咸味肽，其氨基酸序列为Gly-Lys。2020年，Zheng等[11]在FA31中发现Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu和Phe-Ile 5种咸味肽。由此证明，对咸味肽的研究尤为重要，咸味肽产品的开发也成为重中之重。

1.2 咸味肽结构特点

天然蛋白质中存在的氨基酸除甘氨酸外均为L型，氨基酸本身及其盐类大多呈苦味、甜味，少量呈鲜味、咸味和酸味，D型氨基酸几乎都呈甜味[12]，咸味肽则主要是由L型氨基酸组成，且主要是2个及以上氨基酸肽键衔接而成，咸味二肽结构见图1[13]。

图1 咸味二肽Asp-Asp的结构图Fig.1 The structure diagram of salty dipeptide Asp-Asp

咸味肽具有刺激性小、延续时间短、消失速度快、强弱对比差异明显、阈值和差阈都较小等特点，咸度随咸味肽浓度的变化而迅速发生变化，并且人感受咸味的浓度可变范围小，会与其他呈味发生协同相互作用，这也是咸味常作调味主味的重要原因之一。

2 咸味肽分类

咸味肽是从食物中提取的、由氨基酸组成的、呈咸味的多肽。按食物来源分，咸味肽可分为动物源咸味肽、微生物源咸味肽和植物源咸味肽，主要是以动物源咸味肽为主。

2.1 动物源咸味肽

动物源咸味肽是从动物性食物中通过生物酶解技术制备得到的咸味肽。目前，咸味肽的动物性来源主要包括鸡骨、猪骨、牛骨、鱼肉、虾蟹等。近年来，针对动物源咸味肽的研究不断涌现，王欣等[14]研究表明通过木瓜蛋白酶与中性蛋白酶的协同作用，不仅能充分水解哈氏仿对虾蛋白，也能提取更多的咸味肽。吴迪等[15]研究表明通过响应面优化法得到酶解小黄鱼制备咸味肽的最优工艺。

2.2 微生物源咸味肽

微生物源咸味肽是从微生物中制备得到的咸味肽，但目前研究报道相对较多，主要来源是酱油、奶酪、酵母、双孢菇等。Zhu等在无盐酱油的研究中提取了3种咸味肽，氨基酸序列分别为Ala-Phe、Phe-Ile、Ile-Phe。吴阳[16]以双孢菇为原料，采用高温蒸煮法、超纳滤膜分离法、葡聚糖凝胶层析法和反高效液相色谱法制备呈现咸鲜味的浓厚呈味肽。Zheng等在天然酵母FA31中发现Asp-Asp、Glu-Asp、Asp-Asp-Asp、Ser-Pro-Glu和Phe-Ile 5种咸味肽。

2.3 植物源咸味肽

植物源咸味肽是从植物蛋白中通过生物酶解技术制备得到的咸味肽。目前研究表明，从植物蛋白中提取咸味肽的研究较少，主要来源是藻类、海带、大豆等。彭增起等通过对大豆蛋白进行酶解、分离纯化，得到一种纯净的咸味肽，其氨基酸序列为Gly-Lys。我国是农业大国，农业资源丰富，从植物蛋白中提取咸味肽会成为未来咸味肽发展行业的必然趋势。

3 咸味肽受体与机制

3.1 咸味肽受体

目前研究发现，咸度受体包括瞬时受体电位香草酸亚基和上皮Na+通道(ENaCs)两种受体，其中ENaCs是主要咸度受体[17]，由3个亚基组成，分别为α，β和γ，依次在舌的轮廓、叶状和菌状乳头的味觉受体细胞(taste receptor cell, TRC)中表达，并形成孔状结构，发挥ENaCs的作用，但由于β和γ亚基在轮廓乳头和叶状乳头的TRC中表达较少，所以ENaCs主要定位表达在舌前部的菌状乳头的TRC中。ENaCs咸味传感受体见图2。

图2 ENaCs咸味传感受体Fig.2 ENaCs saltiness sensor receptors

3.2 咸味机制

咸味肽电离出阳离子，一些味觉传导过程将化学信号转变成分子第二信使，促使阳离子与味觉受体细胞发生相互作用，激活其表面的离子通道，引发味觉受体细胞去极化和Ca2+释放，进而传送给大脑产生“咸味”信号，咸味机制由此产生[18]。咸味传导机制见图3。

图3 咸味传导机制Fig.3 The saltiness transmission mechanism

4 咸味肽构效关系

咸味肽的呈味特性与氨基酸的组成、性质、空间结构、肽链的长度及氨基酸的序列密切相关，其形成结构式见表1。

表1 咸味肽、咸味肽类似物和咸味增强肽的结构式Table 1 The structural formulas of salty peptides, salty peptide analogs and salty enhancing peptides

4.1 氨基酸性质

咸味肽的呈味特性与组成氨基酸的性质有关。天然蛋白质存在的氨基酸除甘氨酸外均为L型，20种氨基酸中组成咸味的氨基酸主要有天冬氨酸和谷氨酸，咸味增强肽主要由精氨酸组成，而咸味肽类似物主要由瓜氨酸(Orn)等碱性氨基酸组成。

4.2 氨基酸组成

目前报道的咸味肽主要为咸味二肽和咸味三肽，其味感主要取决于由天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸连接而成的二肽、三肽，其中肽链越长，咸味越不明显[22]，且不同的氨基酸组成所呈现的咸味阈值不同，如Asp-Asp 咸味二肽的咸味阈值为4.79 mol/L，Glu-Asp咸味二肽的咸味阈值为3.14 mol/L[23]。

同时，部分呈味肽本身不具有咸味，但具有增咸效果，这类肽称为咸味增强肽。咸味增强肽的氨基酸组成与咸味肽不同，咸味增强肽增咸效果显著，不同增咸肽的组合具有不同的增咸效果[24]。

4.3 氨基酸序列

不同特性的氨基酸残基在肽链中的位置对咸味肽的呈味特性有着重要影响。多肽中氨基酸组成相同的咸味肽，也会存在呈味强度的较大差异甚至是呈味特性的差异。同时，在咸味五肽的研究中发现，五肽分子必须具有带正电分子团、带负电分子团等极性氨基酸，但是这一结论并不适用于其他大小的肽段。

4.4 肽的空间结构

对于含3个氨基酸以上的呈味肽，必须考虑呈味肽的空间构象[25]。肽链长度直接导致结构和电荷分布差异，或结构中含有羰基、羧基或分子中含有较多酸性氨基酸，这些因素导致很难从简单的一级结构清楚地解释预测咸味肽结构和呈味特性的关系。关于肽的空间结构，可从肽与受体的结合研究咸味肽的呈味特性，但目前未见报道。

综上所述，咸味肽的呈味特性与氨基酸的性质、不同氨基酸组成、肽的空间结构及氨基酸的序列密切相关，从咸味肽的构效关系中研究咸味肽，能使咸味肽的开发得到较好的发展。

5 咸味肽制备合成技术

咸味肽的制备技术主要包括化学水解法[26]、酶水解法[27]、基因工程法[28]和微生物发酵法[29]，合成技术主要包括固相合成和液相合成。制备技术中常用的方法主要是酶水解法和微生物发酵法，而合成技术中常用的方法是固相合成法。

5.1 制备技术

5.1.1 化学水解法

化学水解法主要包括两种，分别为酸水解法和碱水解法，其中酸水解法不易控制时间和温度对水解度和多肽得率的影响，水解后产生大量游离氨基酸和少量多肽，蛋白原料中含有碳水化合物时会产生酸味，未精制的水解产物也会产生臭味或者其他异味[30]，同时，易破坏敏感性氨基酸，有一定的毒性、致癌性，因此，酸水解法不宜成为制备咸味肽的方法。而碱水解法则易生成L型和D型的氨基酸多肽混合物，易引起消旋性和破坏敏感性氨基酸，导致营养成分的流失，且设备要求高，易造成环境二次污染。因此，这两种制备方式在实际生产中应用较少。

5.1.2 酶水解法

酶水解法是以蛋白质为底物，选择适当的蛋白酶，在最适条件下与底物结合来获得大量具有多种特性的呈味肽[31]。此方法酶解后生成游离氨基酸和大量不同分子量的肽，水解度较高时，会生成大量小分子肽，此时酶解液会呈现明显的鲜咸味。此方法具有反应条件温和、过程可控、酶专一性强、肽得率高及副反应少等优势，特别是在风味和营养方面，能够得到最大保留，在制备呈味肽方面具有独特的优势，因此，咸味肽的制备技术通常采用酶水解法。

5.1.3 基因工程法

基因工程法指从动植物的基因组分离出带有目的基因的DNA片段，而后将此DNA片段以适当的载体和特定方式导入受体细胞，通过受体细胞表达得到所需的呈味肽[32]。该方法原料廉价、效率高、产量大，所制备的肽具有高产率和高特异性。但该技术在DNA重组过程中对灭菌处理有严格要求，目前尚不成熟，有待进一步研究。

5.1.4 微生物发酵法

微生物发酵法是利用微生物通过发酵底物来生产呈味肽，其通过微生物发酵将原料经特定代谢途径产生可充分水解底物的酶，通过此酶将蛋白质水解为呈味肽[33]，该方法几乎不需要使用化学试剂，无化学残留风险，生产成本较低，菌种易培养，培养周期短，便于工业化生产和大规模推广。同时，酶解产物中会产生发酵香味，能进一步提高呈味肽的感官性能，为咸味肽产品的开发提供一种特殊的风味体现，但该方法中不同菌种效果差异明显，不易控制。

5.2 合成技术

化学合成技术主要是通过氨基酸缩合反应形成酰胺键来实现多肽合成[34]，在合成的过程中，能够保证目标多肽的定向性，大量合成所需要的目的多肽，主要分为固相合成法和液相合成法。

5.2.1 固相合成技术

固相合成技术是将目标多肽的第一个氨基酸的C端与固相载体相连，再以其N端作为合成起点，经过脱去、反应、接长，重复操作，达到所需的目标多肽链长度，再将其从树脂上裂解下来，分离纯化，最后得到目标多肽[35]。固相合成技术主要分为Boc合成法和Fmoc合成法。Boc合成法在多肽不断合成的过程中，需反复用酸切除Boc保护基，引入一些副反应产物，而Fmoc合成法采用温和的碱处理进行脱保护，此方法反应条件温和、副反应少、产率高，因此，Fmoc合成法在多肽固相合成技术领域应用十分广泛。目前，固相合成法被广泛应用于多肽和蛋白质的合成及研究领域，特别是小分子多肽的合成[36]。此方法技术成熟，由原来的手工操作合成转变为全自动多肽合成仪合成。因此，咸味肽的合成多采用固相合成法，且合成的咸味肽被用于验证鉴别从食物中提取的咸味肽。咸味肽固相合成流程见图4。

图4 咸味肽固相合成流程图Fig.4 The flow chart of solid-phase synthesis of salty peptides

5.2.2 液相合成技术

液相合成技术是利用多肽片段在溶液中的化学专一性和选择性，自发连接合成长肽的合成技术[37]，此技术用于合成长肽，具有纯度高、易于纯化等特点。多肽液相合成技术又可分为逐步合成法和片段合成法。逐步合成法操作简易迅速，主要应用于生物活性肽的合成。片段组合法又分为两种，即天然化学连接和施陶丁格连接，主要用于长肽合成。由于咸味肽的肽段越长，咸味越不明显，因此，多肽液相合成技术在咸味肽的制备中应用较少。

6 咸味肽分离纯化鉴定技术

6.1 咸味肽分离纯化技术

目前分离纯化咸味肽的技术越来越成熟广泛，常用于咸味肽分离纯化的方法主要包括离子交换色谱、超滤以及凝胶过滤色谱等分析技术。咸味肽分离纯化技术主要是依据酶解产物的组成、特点、性质等多种因素决定。为得到较为纯净的咸味肽，一般将多种分离纯化技术手段联合使用，达到对咸味肽分离纯化的目的。

6.1.1 超滤技术

超滤(ultra-filtration,UF)技术是通过超滤膜表面的孔结构对不同大小分子量的物质进行选择性分离和浓缩的高新技术手段[38]。其原理是在密闭容器中的两类或者多类大小不同的物质溶液在适当空气压力的作用下促使其透过超滤膜，小于超滤膜孔直径的小分子溶质可透过膜被收集，而大于超滤膜孔直径的大分子溶质则被薄膜截留浓缩被回收，最终实现不同大小溶质溶液的分离和浓缩，常用于分离不同分子量的肽段，主要用于10，5，3，1 kDa分子量肽段的分离。超滤是一种快速、有效获得并浓缩目标分子质量的肽的方法[39]，其不能得到纯化的肽，需进一步用色谱分离纯化方法得到单一纯化的肽。Liu等[40]利用超滤技术对大豆蛋白的美拉德产物进行分离纯化，最终制备得到大豆蛋白抗氧化活性肽。

6.1.2 凝胶过滤色谱技术

色谱法是利用流动相中的不同物质在不同固定相的选择性分配，通过流动相中的混合物流经固定相的选择性不同进行洗脱，不同的物质会以不同的流速沿固定相流出，最终实现对不同物质之间的分离，收集所需要的物质[41]。常用于分离咸味肽的色谱分析技术主要是凝胶过滤色谱技术，依靠各物质的分子大小不同而分离，进一步分离纯化咸味肽。张顺亮等[42]通过对比Sephadex G-15和Sephadex G-50凝胶色谱柱分离牛骨酶解产物得到咸味肽，结果表明，不同凝胶色谱柱制备的咸味肽咸度较强，且均有相对分子质量为849.38的咸味多肽。

6.2 咸味肽鉴定技术

随着呈味肽鉴定技术的快速发展，越来越多高效快速的方法可用于鉴定咸味肽，目前主要的鉴定技术有液相色谱-质谱联用技术、电喷雾离子化、基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪、核磁共振技术和二元色谱法等，促进咸味肽呈味特性的进一步挖掘，且有助于解释食品产生微妙风味的机理。同时，有利于提高食品品质，提高生产效率。

6.2.1 质谱法

质谱法(mass spectrometry，MS)，即用电场和磁场将运动的离子按质荷比分离后进行分析检测的方法[43]。随着质谱技术的发展，质谱分析的每个阶段都有多种方法可供选择。电离有基质辅助激光解吸电离、电喷雾离子化等[44-45]，质量分析器主要有离子阱、飞行时间、四级杆以及四级杆串联飞行时间等[46-47]，不同质谱技术的组合构成了不同特性和不同层次的质谱检测平台，在灵敏度、准确性、通量、操作等方面具有不同的特性。质谱法具有高灵敏性、高准确性、高通量性、高精度性、定量动态范围大、操作快捷方便等优点，可以准确测出咸味肽氨基酸序列和相对分子质量。李迎楠等[48]通过超滤装置、Sephadex G-25凝胶色谱柱、高效液相色谱分析仪对牛骨酶解产物中的咸味肽进行分离、纯化、收集及初步分析，再借助于质谱仪对咸味肽进行分析鉴定，得到咸味肽的相对分子质量可能为679.5109。

6.2.2 核磁共振技术

随着二维、三维以及四维核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术的广泛应用，分子生物化学、计算机技术的快速发展，NMR图谱在蛋白多肽中的分析应用较多，目前，已逐渐成为蛋白多肽分析的主要技术之一[49]，可用于鉴定咸味肽的氨基酸序列及混合物中各组分的含量等。

6.2.3 傅里叶变换红外光谱技术

傅里叶变换红外光谱技术(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)是通过特定波长的红外光照到呈味肽样品上被反射或吸收的红外光谱技术[50]。这种技术可以在多种不同环境下采集不同大小的咸味肽的光谱数据。咸味肽的不同结构区域会产生不同的特征吸收带，这些信息可以被解析来确定咸味肽的二级结构。这种二级结构的主要组成部分是β折叠和α螺旋，它是呈味肽结构中最重要的一个方面[51]。

7 咸味肽应用研究

咸味肽作为呈味肽的一种，具有味感细腻温和、醇厚浓郁等特点，味感和咸度效果均优于盐类和氨基酸类咸味剂。目前，咸味肽的应用越来越广泛。按其应用可分为增咸食用盐、咸味增强剂、咸味香精。

7.1 增咸食用盐

增咸食用盐是为响应国民减盐而开发的一种具有增强食盐咸味、减少食盐摄入的咸味肽开发产品，主要应用于调味品领域。咸味肽的加入能够显著提高食盐的咸度，减少食盐中钠离子的含量，进而减少因人体摄入大量钠离子而引发的高血压、心血管等疾病的发病率。迟韵等[52]通过添加一定比例的精制食盐、水果有机酸、酵母提取物和抗结剂，提供了一种天然、绿色、健康和提高精制盐咸度的增咸食用盐技术配方。在减少食盐和不引入钾盐的情况下，增强人体味蕾对咸度的感知，真正做到减盐而不减咸。

7.2 咸味增强剂

咸味增强肽是通过蛋白生物酶解技术制备的蛋白酶解产物，口感鲜咸，能够增加咸味，且具有营养保健等功效，可用于开发具有营养功能的调味品。Schindler等[53]通过在对鱼精蛋白进行酶解、分离、纯化的研究中发现，制备的精酰胺二肽具有明显的增咸效果。王欣等通过木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的协同作用水解哈氏仿对虾提取咸味肽，得到的咸味肽能将10 mmol/L NaCl溶液的感官咸度提高到55 mmol/L NaCl溶液的感官咸度，具有明显的增咸效果。陈瑞霞等[54]利用木瓜蛋白酶酶解淘汰蛋鸡鸡肉制备咸味增强肽，结果表明酶解液的加入能将55 mmol/L NaCl溶液的咸度提升26.2%。

7.3 咸味香精

近年来，咸味香精发展迅速，占据香精市场的核心地位，是我国香精市场的主导产品。目前，咸味香精的原料主要来源于动、植物的氨基酸和还原糖，通过酶解和美拉德反应等工艺制备而成，其中美拉德反应是制备香精的重要反应，利用美拉德反应生产咸味香精成为重要研究内容，相比调制的香精，其制备的咸味香精香气更加醇厚，口感更加细腻。咸味香精是咸味肽与还原糖的美拉德反应产物，能够增强食品的咸鲜味、醇厚感和持续感，通常被用于制作调味料。郑家伦等[55]以大豆粕酶解液为基料，通过美拉德反应制备咸味香精，并利用HPLC和GC-MC对咸味香精的氨基酸组分和香气成分进行分析，检测出对生成肉香味具有重要作用的癸醛、2-癸酮、2-己基呋喃等挥发性物质。

8 展望

咸味肽的开发与其原料来源、结构、构效关系、制备合成技术、分离纯化鉴定技术的发展有着密切的联系。咸味肽受其原料来源的不同，制得的咸味肽咸度以及氨基酸序列也不同，在产品加工中也会有不同的应用和限制，如从虾蟹中提取的咸味肽，对于那些海鲜过敏的人群来说，用其加工的产品将不能食用。此外，咸味肽受其氨基酸的组成、性质、空间结构、肽链的长度及氨基酸的序列的影响，造成咸味强度和阈值不同，且相同氨基酸组成的咸味肽因其结构序列和空间结构不一致，咸度阈值也不同，这为咸味肽的深入机理研究及合成技术提供了参考。目前，食盐中钠离子的摄入量受到严格控制，因此对于咸味肽的研究及产品开发尤为重要。咸味肽可以应用于增咸食用盐、咸味增强剂和咸味香精等调味产品的开发中，不仅能够降低钠离子的摄入量，保证食物具有明显咸度，而且能够在适当的条件下替代食盐用于食物调味，可以更好地被人体消化吸收利用，其开发与应用前景广阔。